[发明专利]GM-CSF敲低及其中和单链抗体分泌的嵌合抗原受体T细胞构建与应用

说明书

本发明公开了一种分泌中和GM‑CSF的anti‑GM‑CSF scFv、以及GM‑CSF基因敲低的第四代嵌合抗原受体(CAR)‑T细胞的构建和应用。本发明通过分泌中和GM‑CSF的anti‑GM‑CSF scFv、合并CAR‑T细胞内GM‑CSF基因敲低，预防或减缓细胞因子释放综合征和神经毒性的发生发展，从而提高CAR‑T疗法的整体安全性。此外，本发明将编码microRNA的核苷酸序列插入于EF1α启动子内，从而不影响慢病毒载体的包装滴度。

一、技术领域

本专利属于生物技术工程领域，具体涉及到一种分泌中和GM-CSF的anti-GM-CSFscFv、合并GM-CSF基因敲低的第四代嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的构建与应用。

二、技术背景：

CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。近几年，CAR-T治疗恶性血液系统疾病显现出惊人的效果，但该疗法的应用却受到其相关毒副反应的限制，主要包括细胞因子释放综合征和神经毒性。细胞因子释放综合征是指在免疫细胞与肿瘤细胞作用的过程中，大量释放细胞因子，这些细胞因子又会引发进一步的连锁反应，如过度炎症反应(如高热寒战、低血压、呼吸困难、凝血障碍等)，进而导致器官受损和脑肿胀，最终危及生命。CAR-T神经毒性临床表现有头痛、意识模糊、认知改变、幻觉、言语障碍、共济失调、失用症、面神经瘫痪、震颤、辨距障碍和癫痫等。最新研究表明：因单核细胞和巨噬细胞参与了CAR-T细胞治疗后细胞因子释放综合征和神经毒性的发生发展，通过Lenzilumab抗体中和GM-CSF或GM-CSF基因敲除可预防或延缓细胞因子释放综合征和神经毒性的发生，且可显著增强CAR-T细胞功能。

本发明利用RNA干扰技术高效敲低CAR-T细胞内GM-CSF表达、合并分泌表达中和GM-CSF的anti-GM-CSF scFv，预防或减缓细胞因子释放综合征和神经毒性的发生发展，提高CAR-T疗法的整体安全性。

此外，若编码microRNA的核苷酸序列位于慢病毒载体EF1α启动子的下游，则因干扰了293T细胞内源性microRNA的转运和加工、导致慢病毒载体包装滴度显著下降，故本发明将编码microRNA的核苷酸序列插入在EF1α启动子内。

三、发明内容：

针对CAR-T疗法的重大毒副反应(细胞因子释放综合征和神经毒性)，发明了一种分泌anti-GM-CSF scFv以及靶向GM-CSF的mircroRNA的CAR-T细胞(以靶向CD19的第四代CAR-T为例)，从而提高CAR-T疗法的整体安全性。

通过基因工程技术构建plenti-CD19(microRNA#GM-CSF)-anti-GM-CSF scFv质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转导T细胞，培养五天后通过流式分别检测anti-CD19 CAR的表达率，体外验证CAR-T细胞对表达CD19阳性细胞的体外杀伤作用。与现有技术相比，本发明涉及如下优点：

1.本发明通过CAR-T细胞内GM-CSF基因敲低、合并分泌中和GM-CSF的anti-GM-CSFscFv，预防或减缓细胞因子释放综合征和神经毒性的发生发展，从而提高CAR-T疗法的整体安全性。

2.为了不影响慢病毒载体的包装滴度，本发明将编码microRNA的核苷酸序列插入在EF1α启动子内。

四、附图说明：

图1是plenti-anti-CD19-anti-GM-CSF scFv质粒示意图。

图2是plenti-anti-CD19(GM-CSF knockdown)-anti-GM-CSF scFv质粒示意图。