[发明专利]蛋白激酶Fused编码基因及其在防治小菜蛾中的应用

说明书

本发明公开了一种昆虫蛋白激酶，其编码基因Fused，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还公开了Fused基因特异片段，用于dsRNA的合成，该dsRNA注入Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾3龄初幼虫体腔后，小菜蛾生长发育迟缓，并最终导致小菜蛾在幼虫期和蛹期的死亡。本发明为小菜蛾Bt抗性治理提供了新的靶标，因此具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于病虫害防治和生物技术领域，具体涉及小菜蛾蛋白激酶Fused基因及其在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）可以产生多种杀虫晶体蛋白，从而特异性杀死多种田间重大害虫。基于Bt杀虫蛋白研发的Bt制剂是目前世界上用量最大的微生物杀虫剂，而且编码Bt杀虫蛋白的多个基因也已经被转入到多种重要的经济作物中（简称Bt作物），Bt制剂和Bt作物在防治田间害虫方面发挥了重要作用。然而，Bt制剂大量及不合理的使用以及Bt作物的大面积推广应用不可避免的导致害虫快速进化产生了抗药性，导致田间害虫防治失败。在这种背景下，昆虫Bt抗性分子机制的揭示以及新型害虫防治技术的研发迫在眉睫。

目前，致力于研发物种特异性生物杀虫剂和新一代转基因作物的RNAi的害虫防治技术被认为是未来田间害虫防治的希望所在。而且，Bt+RNAi的新一代转基因作物能有效的延缓田间害虫的抗性问题，必将在未来田间害虫防治中发挥关键作用。然而，基于Bt+RNAi的新型害虫防治技术的关键在于害虫高效安全致死靶标基因的筛选。小菜蛾是十字花科作物重要害虫，全世界每年由小菜蛾危害所造成的直接和间接经济损失已高达40-50亿美元，而我国小菜蛾危害每年引起的经济损失已高达到7.7亿美元，防控难度极大。而且，小菜蛾是第一个也是目前唯一的一个在田间对Bt制剂产生高抗性的害虫。因此，开展小菜蛾Bt+RNAi高效安全致死靶标基因筛选研究意义重大。

蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化的酶，通过催化磷酸转移至底物蛋白质特定氨基酸残基上来调控底物蛋白定位以及活性。蛋白激酶是调节细胞功能的关键因子，构成了功能最多样的基因家族之一，依据其被磷酸化的氨基酸残基种类可分为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶等。生物体细胞内信号途径的关键基因功能和进化相对比较保守，然而，在基因序列上也会存在物种特异性。而且，我们前期研究发现小菜蛾丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAPK信号途径参与了小菜蛾Bt抗性分子机制。因此，可以寻找功能重要、进化保守且序列存在物种特异性的信号途径关键基因作为小菜蛾RNAi高效安全致死靶标基因。

Fused基因即编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该基因主要参与生物体刺猬信号途径(Hedgehog signaling pathway)并在生长发育过程中发挥了关键作用，缺失该基因对昆虫具有致死作用。而且，在不同物种中该基因中间序列不保守。更关键的是，在我们前期小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性的转录组和RNA-Seq研究发现，Fused基因可能在Bt抗性小菜蛾中过表达从而参与小菜蛾Bt抗性。因此，小菜蛾Fused基因可以作为一种潜在的特异性强的新一代Bt+RNAi害虫防治技术的安全高效靶标基因，从而非常值得开展详细的研究。

发明内容

利用本发明人实验室前期完成的Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据，发现一个潜在的可能与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性相关的上调表达Fused基因。为了验证该基因是否参与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性，首先克隆了Fused基因的全长序列，利用qPCR技术检测后发现，该基因的表达量在Bt Cry1Ac杀虫蛋白在抗性小菜蛾中肠中显著高于敏感小菜蛾，而且随后的RNAi功能实验利用特异性dsRNA沉默该基因的表达量能导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的敏感性降低，因此，实验结果证实Fused基因参与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制。