[发明专利]一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用

说明书

本发明涉及一种适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法、应用，属于兽医生物学技术领域，所述Vero33细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17694，保藏日期为2019年5月27日，其驯化方法为：1.贴壁Vero细胞的传代与培养；2.驯化贴壁Vero细胞适应低血清悬浮培养基；3.驯化Vero细胞适应无血清悬浮培养环境。同时本发明提供了无血清悬浮培养Vero33细胞在生产猪流行性腹泻病毒和鸡传染性法氏囊病毒中的应用及方法，可以在无血清的条件下，全悬浮培养病毒，扩大生产规模，满足GMP生产技术要求，有更好的市场前景。

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及无血清全悬浮Vero33细胞的驯化方法及在兽用疫苗抗原生产中的应用。

背景技术

悬浮培养工艺已经广泛应用于生物制药领域，而且已经在生物制药领域展现出了明显的优势。与转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术的最大优势在于：第一、单位面积内有效工作细胞数量增加；第二、全封闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量获得提高；第四、生产疫苗所用的劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。

全悬浮培养工艺是一种不依赖血清和载体的细胞培养工艺。利用悬浮培养驯化的方法将Vero贴壁细胞(非洲绿猴肾细胞)驯化为无血清全悬浮培养的Vero细胞，并通过筛选获得高病毒产量的悬浮细胞株，应用于兽用疫苗抗原猪流行性腹泻变异株和传染性法氏囊流行株的无血清全悬浮生产，实现抗原生产工艺和质量的提升，生产成本的降低。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种无血清全悬浮培养的Vero33细胞株及该细胞在培养兽用疫苗抗原中的应用，所述Vero33细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.17694，保藏日期为2019年5月27日。该VERO33细胞株降低生产成本，提高下游纯化的效率，快速稳定的扩大生产规模，质量实现均衡稳定。

同时本发明设计了上述的适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株的驯化方法，所述驯化方法包括以下步骤：

(1)制备用贴壁细胞的传代与培养

将复苏后的Vero细胞置于含8％胎牛血清的MEM-NEA培养液中进行培养，待Vero细胞长满单层时，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA 37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％胎牛血清的MEM-NEA细胞培养液终止消化，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2-3代；

(2)驯化贴壁细胞适应低血清悬浮培养基

取长满单层Vero贴壁细胞的培养瓶，用0.25％胰蛋白酶-EDTA 37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％胎牛血清的MEM-NEA细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清液；用含2％胎牛血清的Vero601悬浮培养基重悬细胞，混匀并计数，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到摇瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为150r/min，观察并计数，连续传代5～6代，待细胞密度大于2×10⁶cells/ml，活率95％，细胞生长稳定，认为Vero细胞已适应低血清培养基培养；