[发明专利]用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用

说明书

本发明提供一种用于生产光学纯1,3‑丁二醇的重组菌及其应用。所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上而成。利用本发明的大肠杆菌工程菌在微氧的条件下发酵廉价有机碳源如葡萄糖、蔗糖或甘油等，1,3‑丁二醇相对于底物的得率可以达到0.4g/g以上，且R型1,3‑丁二醇纯度达到99％以上，具有重要的工业应用潜力。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

背景技术

1,3-丁二醇是一种具有重要工业应用价值的二元醇，其可以被用作化妆品的溶剂，同时可以用作单体来合成聚酯、聚氨酯及生物增塑剂。同时光学纯的1,3-丁二醇可以用作医药中间体来合成许多药物。但是化学法合成的1,3-丁二醇都是外消旋体，无法直接用作医药中间体。因此，利用生物法生产光学纯1,3-丁二醇具有重要应用价值。

CN201610481598.X和CN201080029715.X分别公开了两种1,3-丁二醇的生产方法，其主要是在厌氧条件下表达至少一种编码以足够的量表达的1,3-BDO通路酶的外源性核酸，以生产1,3-丁二醇。但该过程的生产效率低，1,3-丁二醇的最高产量低于2mM，不具有工业可行性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌及其应用。

本发明构思如下：提供一种重组大肠杆菌，其是通过上调大肠杆菌的pntAB基因并同时下调sthA基因从而极大提高细胞内的NADPH基因以满足1,3-丁二醇合成途径所需要的还原力NADPH，从而提高1,3-丁二醇的产量。本发明同时通过酶的设计构建了Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum的丁醛脱氢酶突变体，其是将丁醛脱氢酶第273位亮氨酸突变为苏氨酸而成，在大肠杆菌中表达该突变体可以极大提高1,3-丁二醇的产量。本发明同时通过敲除adhE基因，ldhA基因，pta基因，ackA基因提高了乙酰-CoA流向1,3-丁二醇合成途径的代谢通量，进一步提高了1,3-丁二醇的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于生产光学纯1,3-丁二醇的重组菌，所述重组菌是将phaA、phaB、bld和yqhD基因通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上而成。

其中，所述phaA基因为乙酰CoA酰基转移酶基因，来源于Cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

所述phaB基因为3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶基因，来源于Cupriavidusnecator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：

(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。

所述bld基因来源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。

所述yqhD基因为醇脱氢酶基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：

(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质。