[发明专利]检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物及应用

权利要求书

1.一种检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R；

所述qNCD-ORF7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：5’-AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’；

所述qNCD-ORF7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：5’-AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’。

2.一种特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含DNA裂解液、扩增反应液、引物混合液和阳性对照液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述DNA裂解液包括100mM NaCl、pH值为8.0的10mM Tris-HCl、pH值为8.0的25mM EDTA、1％W/V的十二烷基硫酸钠和1.7μg/μL蛋白酶K；所述扩增反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。

4.根据权利要求2所述的特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其特征在于，所述引物混合液包括100pmol/μL的qNCD-ORF7-F和100pmol/μL的qNCD-ORF7-R；所述阳性对照液包含枯草芽孢杆菌NCD-2菌株DNA，浓度为200pmol/μL。

5.一种如权利要求1所述的特异性引物在制备用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒中的应用。

6.一种如权利要求1所述的特异性引物在检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中的应用。

7.一种定性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品中的基因组DNA；

(2)PCR扩增：以基因组DNA为模板，以qNCD-ORF7-F和qNCD-ORF7-R为引物进行PCR扩增；

(3)PCR产物观察：取扩增产物进行电泳，电泳结束后进行染色，随后进行PCR产物观察。

8.根据权利要求7所述的定性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR反应体系为：含Mg²⁺的缓冲液5μL、脱氧核糖核苷酸8μL、引物qNCD-ORF7-F 1μL、引物qNCD-ORF7-R 1μL、基因组DNA 1μL、rTaq DNA聚合酶1μL，双蒸水33μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃链延伸10min；

步骤(3)中，所述电泳电压为90-110V，所述电泳时间为35-45min，进行所述染色的染料为Gold View染料，所述染色时间为25-35min。

9.一种定量检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S1)提取待测样品中的基因组DNA；

(S2)实时定量PCR扩增：以基因组DNA为模板，以qNCD-ORF7-F和qNCD-ORF7-R为引物进行实时定量PCR扩增；

(S3)根据扩增结果，对枯草芽孢杆菌NCD-2菌株进行定量。

10.根据权利要求9所述的定量检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的方法，其特征在于，步骤(S2)中，实时定量PCR反应体系为：KOD SYBR qPCR Mix 10μL、浓度为10μM的qNCD-ORF7-F0.4μL、浓度为10μM的qNCD-ORF7-R 0.4μL、50×ROX参比染料0.4μL、基因组DNA 2μL、双蒸水6.8μL；PCR反应条件为：98℃2min，98℃10s、60℃10s、68℃30s、40个循环。