[发明专利]特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用

说明书

本发明提供了一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用，涉及基因工程技术领域。该成套sgRNA包括sgRNA‑L‑1和sgRNA‑R‑2，其中述sgRNA‑L‑1含有负责识别靶片段的如SEQ ID NO.1所示序列；sgRNA‑R‑2含有负责识别靶片段的如SEQ ID NO.2所示序列。该成套sgRNA特异性识别猪CD13基因的第二外显子，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用。

背景技术

猪是我国重要的家畜品种之一，其在农业经济、医学疾病模型和分子遗传学研究中均有重要地位。猪流行性腹泻是一种急性、高度接触性的肠道疾病，该病特征表现为急性肠炎、水样腹泻、呕吐和脱水。其可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率非常高。特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。仔猪腹泻每年给养猪业造成巨大的经济损失，该疾病主要是由大肠杆菌、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus,TGEV)引起的。

白细胞分化抗原13(Cluster of differentiation 13,CD13)也称为氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)，是一类单次跨膜的II型膜结合金属糖蛋白，也是一种依赖锌离子的蛋白酶，存在于细胞表面。猪CD13含963个氨基酸残基，可被胰蛋白酶分解成2个亚基，分别为95ku的氮端(氨基端)和50ku的碳端(羧基端)。CD13最早作为冠状病毒细胞感染受体的研究是从猪TGEV开始，1992年法国学者研究证实猪CD13为TGEV感染受体，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的APN基因来阻止TGEV对猪的感染。有关猪CD13基因的研究还处在起步阶段，猪CD13作用机制、功能区域及遗传变异研究还不清楚。因此，猪CD13的研究成为国内外的研究热点。

建立一种可以快速、准确、有效地敲除猪CD13基因的方法，获取敲除猪CD13基因的胚胎或细胞，对于研究猪流行腹泻以及抗病猪育种方面具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA，该成套sgRNA敲除效率高且特异性强。

本发明的第二目的在于提供一种成套DNA分子，该成套DNA分子包含编码上述成套sgRNA的DNA分子。

本发明的第三目的在于提供一种上述特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA或上述成套DNA分子的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA，包括：sgRNA-L-1和sgRNA-R-2；

所述sgRNA-L-1含有如SEQ ID NO.1所示序列，所述SEQ ID NO.1所示序列负责识别靶片段；

所述sgRNA-R-2含有如SEQ ID NO.2所示序列，所述SEQ ID NO.2所示序列负责识别靶片段。

优选地，所述sgRNA-L-1含有如SEQ ID NO.5所示序列。

优选地，所述sgRNA-R-2含有如SEQ ID NO.6所示序列。