[发明专利]响应面法优化获得马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的方法

说明书

响应面法优化获得马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的方法属于马铃薯培养基技术领域。本发明首次将响应面法应用在马铃薯组织培养培养基优化中，在前人的单因素试验基础上，以大量元素、微量元素、铁盐、有机物质为试验因素，以植株生长状况为响应指标，设计4因素5水平CCD试验。优化结果表明，最优的马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基中大量元素为MS培养基大量元素质量的63％、微量元素为MS培养基微量元素质量的69％、铁盐为MS培养基铁盐质量的45％以及有机物质为MS培养基有机物质质量的34％。与MS培养基相比，降低了40.61％的矿质元素生产成本，具有很好的实践应用价值。

技术领域

本发明属于马铃薯培养基技术领域，特别是涉及到一种响应面法优化获得马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的方法。

背景技术

马铃薯继代扩繁是工厂化生产的重要途径，长期以来马铃薯脱毒苗继代扩繁主要使用MS(Murashige&Skoog，1962)培养基，MS培养基是针对烟草细胞培养设计的，由于其无机盐和离子浓度较高，养分数量和比例合适，能满足大多数植物细胞的营养和生理需要，因此被广泛应用于组织培养中。

由于马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的成本较高，很难直接应用于工厂化生产，这也导致近些年马铃薯脱毒苗应用面积始终无法提高，仅为栽培面积的10％。再者，马铃薯继代扩繁培养基配方成分多，大多学者只进行了相关方面的单因素试验研究，较少对MS固定培养基组成中的矿质元素浓度进行多因素研究。因此，亟需使用新型试验方法优化出马铃薯继代扩繁培养基，尽可能降低其生产成本。宋鹏慧等研究表明，MS培养基中P、K元素减半对试管苗不会产生不良影响，且在活叶数、有效茎节数、生物量、平均根长以及平均根条数方面优于全量MS培养基。Abdulnour等研究表明，25％B(0.025mM/L)促进了Ca的吸收，且不影响植株的正常生长发育。黄萍等研究表明，MS固体培养基中不添加有机物质对试管苗生长指标的影响无明显差异，且降低了生产成本，提高了经济效益。宋鹏慧等研究表明，选取70％不添加有机物质的MS培养基适宜应用于马铃薯试管苗的生产。

响应面法(response surface methodology，简称RSM)是试验设计，数理统计和最优化技术的一种综合应用。通过建立连续变量曲面模型，对影响响应值的因素水平及其交互作用进行优化和评比，从而可以快速有效地确定多因子系统的最佳条件。RSM已广泛应用于培养基组成、酶水解条件、发酵和食品制造过程。曹小红等应用响应面法对Bacillusnatto TK21发酵产脂肽的培养基进行优化并得到了理想优化值。郭睿等使用响应面法优化出壳聚糖席夫碱合成的最佳工艺条件。杨梅等试验表明响应面法可以优化苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基，但是关于马铃薯继代扩繁培养基的响应面优化至今未见报道。

因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种响应面法优化获得马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的方法用于解决现有技术中关于马铃薯继代扩繁培养基的响应面优化至今未见报道的技术问题。

响应面法优化获得马铃薯脱毒苗继代扩繁培养基的方法，包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，

步骤一、以MS培养基为基准培养基，将MS培养基的大量元素、微量元素、铁盐和有机物质作为4种试验因素，并设定这4种试验因素的质量含量均为100％，各试验因素分别取5个小于100％的质量含量百分比值并输入至Design-expert 8.0.6软件，Design-expert8.0.6软件将4种试验因素各取一个质量含量百分比值形成的培养基数据中随机抽取30种，并进行编号，形成中心组合试验设计CCD试验设计表；

步骤二、按照步骤一的CCD试验设计表中显示的数据称取并配置培养基，每种培养基分装至5瓶培养瓶中，向培养瓶按照30g/L添加蔗糖，按照6g/L添加琼脂并混合，使用1mol/L的NaOH溶液调整培养瓶中的pH值为5.8～6.2；