[发明专利]一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种提高甲基化基因酶切法检测准确性的方法，具体涉及一种双基因监控反应体系、应用双基因监控反应体系的试剂盒及其在检测人结直肠癌中的应用。本发明采用酶切法处理所需检测样本核酸，与重盐法相比，核酸损失更少，检测灵敏度更高；采用双基因监控反应体系，既能监控检测反应时的样本质量，又能监控酶切反应的酶切效率，使检测的准确性大大提高；该发明方法的应用操作简单，成本低。

技术领域

本发明涉及一种提高甲基化基因酶切法检测准确性的方法，具体涉及一种双基因监控反应体系、应用双基因监控反应体系的试剂盒及其在检测人结直肠癌中的应用。

背景技术

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散在DNA序列中，另一种呈现高度聚集状态，称之为CpG岛。在正常组织里，70％-90％散在的CpG是被甲基修饰的，而CpG岛往往是非甲基化的。目前，越来越多的研究表明，CpG岛局部的高甲基化是肿瘤发生的一个重要因素，由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测。

目前市面上针对甲基化检测的方法均采用重盐转化法对检测前的样本进行处理，该方法对样本核酸的损伤很大，导致检测的灵敏度不高，而且存在转化不完全而导致的假阳性结果。

与重盐转化法相比，DNA甲基化检测方法--甲基化敏感性限制性内切酶法可以避免对目的核酸的损伤，从而使检测的准确度大大提高，然而，酶切不完全而导致的假阳性结果也是限制该方法准确性的一个主要问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种提高酶切法检测甲基化准确性的方法，通过创造性的双基因监控反应体系及其应用，达到提高检测准确度的目的。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种双基因监控反应体系，体系中包括目的基因引物对和探针，内参基因GAPDH引物对和探针，酶切监控基因引物对和探针，所述目的基因和酶切监控基因ACTB的引物扩增区域包含多个甲基化敏感性限制性内切酶酶切位点。

优选的，目的基因的探针、内参基因GAPDH的探针和酶切监控基因ACTB的探针分别单独采用FAM、VIC、Cy3、Cy5、ROX、HEX中的一种标记。

优选的，目的基因、内参基因GAPDH、酶切监控基因ACTB采用不同的荧光标记，更优选的，目的基因SFRP1探针采用FAM荧光标记，内参基因GAPDH探针采用VIC荧光标记，酶切监控基因ACTB探针采用Cy5荧光标记。

优选的，目的基因引物探针、内参基因GAPDH引物探针和酶切监控基因ACTB引物探针在1管中进行反应。

一种采用上述的双基因监控反应体系提高酶切法检测甲基化准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、采用核酸提取试剂盒提取样本核酸DNA；

步骤二、取10-100ng所提取的核酸用甲基化敏感性限制性内切酶进行酶切处理；

步骤三、对步骤二中得到的酶切产物采用双基因监控反应体系进行检测。

优选的，步骤二中所述的甲基化敏感性限制性内切酶的量为10-100U。