[发明专利]一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法

说明书

本发明提供的一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：外植体的选择及处理、外植体消毒、接种、愈伤组织的诱导、体胚诱导。本发明的有益效果在于：本发明提供的一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法实现了较高的愈伤组织诱导率、体胚诱导率，获得了细胞体积较小，细胞质致密浓厚，细胞核大且清晰的胚性愈伤组织；解决了蒙古栎扦插生根困难、繁殖系数低、速度慢，无法形成规模化生产以满足市场需求的难题，利用细胞的全能性，实现了在短期内大规模培育出优良植株的目的；为蒙古栎无性繁殖体系的建立、工厂化育苗的实现提供了可能性。

技术领域

本发明属于植物细胞培养技术领域，具体涉及一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法。

背景技术

蒙古栎(Quercus mongolica)是壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus)植物，又名蒙栎、柞栎、柞树，属落叶乔木。是中国国家二级珍贵树种，也是中国东北林区中主要的次生林树种。产于中国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北等省区。俄罗斯、朝鲜、日本也有分布，世界多地有栽种。蒙古栎因其树形高大，可作园林园景树或行道树，树形好者可为孤植树做观赏用。蒙古栎种实营养价值很高，含淀粉55.79％，还含有多种氨基酸、胡萝卜素、维生素等，其口感和营养价值远高于目前市场上出售的淀粉制品，还可提取大量单宁，可用于止泻止痢，具有很高的药用价值。

由于蒙古栎具有较高的观赏价值、经济价值以及重要的药用价值，市场需求不断扩大。然而由于蒙古栎良种严重匮乏，且生长周期长，结实期晚，产量低，种子每3-5年出现一次大年，加之种子不耐贮藏，在收集和贮藏期间容易受到多种昆虫侵害，这些特点都使得蒙古栎种子园建立困难。扦插、嫁接等常规无性繁殖方式虽然能长期稳定地保持母本的优良性状，但是蒙古栎生根困难，繁殖系数低，速度慢，无法形成规模化生产，难以满足市场的需求。

所以急需开发一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法，利用细胞的全能性，从植物体分离出符合需要的组织、器官等，进行培养从而获得再生植株，这样既能保持其优良特性，又能不受季节限制的在短期内大规模培育出优良植株，为蒙古栎无性繁殖体系的建立、工厂化育苗及基因工程等技术提供理论基础和技术支持。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法。

本发明提供的一种有效促进蒙古栎球形胚发生的体细胞培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择及处理：7月上旬，从健康已结实成年蒙古栎母树上采集无虫害饱满的种子，剥去所述种子的外部壳斗及果壳，在流水下清洗1h后移至无菌工作台；

(2)外植体消毒：将经过步骤(1)处理后的所述种子用75％酒精消毒30s，无菌水漂洗3次，然后用0.1％升汞消毒12min，无菌水漂洗3-5次；在消毒及漂洗过程中，需要连续摇动瓶身并轻微搅拌，使所述种子与消毒液充分接触，实现彻底消毒和漂洗；

(3)接种及愈伤组织诱导：用无菌解剖刀切除所述种子的合子胚子叶，得到去子叶合子胚，并将所述去子叶合子胚以下胚轴和胚根紧贴培养基的方式接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，培养5天后将所述愈伤组织诱导培养基上生长的外植体在无菌条件下转接到相同的新鲜的所述愈伤组织诱导培养基中，以防止褐变；之后继续培养2周，外植体存活率为50.0％，此时发生轻微的愈伤组织化，获得愈伤组织，所述愈伤组织生长健壮，呈白色颗粒状，能长时间保持新鲜，可多次继代增殖，愈伤组织诱导率达85.7％；

(4)体胚诱导：将在愈伤组织诱导培养基上培养3周后，获得的白色颗粒状愈伤组织接种于体胚诱导培养基上，诱导培养4周左右，得到体细胞胚胎，且体胚诱导率达72.3％。

作为一种优选的方案，步骤(3)中所述愈伤组织诱导培养基的组成为MS+1mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.5g/L水解酪蛋白。