[发明专利]一种胶体金免疫层析卡的制备方法

说明书

本发明公开了一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板、上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫，上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫依次粘贴在底板上，所述胶体金结合垫为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜,本发明对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成探针，DMD基因相关致病突变序列进行富集(外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、已知突变和未知突变)构建蛋白抗体。

技术领域

本发明属于胶体金免疫层析卡技术领域，具体涉及一种胶体金免疫层析卡的制备方法。

背景技术

假肥大性肌营养不良（DMD）， 也称 Duchenne型肌营养不良症（DMD） ( OMIM310200 ) ，是最常见的一类进行性肌营养不良症，患病率为 3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传，主要是男孩发病，女性为致病基因的携带者，通常5岁左右发病，肌萎缩是进行性的，这是本病的特点，预后差，目前对DMD缺乏有效的治疗，肌营养不良症尚无特效药物和根治方法,包括基因疗 法和施用皮质类固醇。

现有的肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大，上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受的问题，为此本发明提出一种胶体金免疫层析卡的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶体金免疫层析卡的制备方法，以解决上述背景技术中提出的现有的肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大，上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种胶体金免疫层析卡的制备方法，包括底板、上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫，上样垫、胶体金结合垫、层析膜和吸样垫依次粘贴在底板上，所述胶体金结合垫为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。

优选的，所述层析膜的两端分别搭 接有吸样垫、胶体金结合垫，所述胶体金结合垫的另一端搭接有上样垫，所述 上样垫搭接压住胶体金结合垫的1/4，所述胶体金结合垫搭接压住层析垫的1/5， 所述吸样垫搭接压住胶体金结合垫的1/12。

优选的，包括以下步骤：

胶体金溶液制备：向100ml HauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00— 4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；

胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg/mL-15μg/mLDMD抗体和封闭剂，10000rpm离心30min，将离心下来的沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；

层析垫制备：将DMD抗体用0.01M，pH为7.4的PBS稀释成0.5mg/mL、1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/mL、2mg/mL，检测线J包被DMD抗体，质控线Z包被羊抗鼠IgG，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.2μL/cm进行划线包被后干燥；