[发明专利]一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用。基于本发明研究，ASF病毒核酸与Cas12a、crRNA形成三元复合体时，该复合物中Cas12a的RuvC结构域行使DNase活性，切割带荧光信号标记的单链DNA，通过检测荧光即可得知待检样品中是否含有ASF病毒核酸。并设计了优质crRNA，构建了快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法，对ASF病毒检测效果优异，特异性强、精准度高，灵敏度比荧光定量PCR高10倍以上，反应时间更短，无需昂贵仪器；另外对于病毒含量极低的弱阳性及疑似阳性样品也可通过适当延长反应时间即可确定样品是否含有ASFV。本发明方法能高效、精准检测非洲猪瘟病毒，具有操作简单，无需专业实验室等优点，为该病毒猪场一线快速检测提供有效的方法，对非洲猪瘟早期监测诊断与防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于病原检测技术领域。更具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染家猪和野猪引起的急性、热性、高度接触性传染病，急性型表现为高热、精神沉郁、厌食、皮肤发绀、脾脏肿大出血，发病率和死亡率高达100％。自2018年8月非洲猪瘟进入中国以来，该病迅速席卷全国，造成巨大的经济损失，全国能繁母猪急剧下降，促使我国养猪业及动保相关企业发生颠覆性改变。该病目前尚无疫苗，也无有效抑制非洲猪瘟病毒药物，故早期监测诊断和生物安全对非洲猪瘟防控非常重要。

相比较于传统病原鉴定方法，核酸检测技术是早期检测诊断的利器。现已开发出不少非洲猪瘟病毒核酸检测方法，如荧光定量PCR、普通PCR、LAMP等，但是这些方法均需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，难以满足猪场一线要求，对于病毒含量极低的情况无法实现早期监测。如何更加快速、简便、准确、廉价的检测，是非洲猪瘟病毒核酸检测未来的发展方向。

2018年，Doudna教授实验室向检测体系中加入crRNA和Cas12a蛋白，当靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，该复合物行使其trans切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA(两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光)，从而发出荧光。因此，通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子。

然而，对于非洲猪瘟的防控早期监控预防是极其重要的，一旦非洲猪瘟病毒形成一定规模以后，即使检测到也难有好的手段彻底防控。因此，针对非洲猪瘟病毒的防控，对于无法确定病毒核酸阴阳性的病毒含量极低样品的成功检测，是很关键的，这受的诸多因素的影响，目前上述Doudna教授团队开发的方法尚未进行详细研究，即该技术是否能够运用于弱阳性及很难/无法确定阴阳性样品的检测并准确判定样品阴阳性未知，尚未有相关的深入研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有非洲猪瘟病毒早期监测防控技术的缺陷和不足，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方法简单、快速、精准检测非洲猪瘟病毒的方法。本发明建立的检测方法能够运用于猪场生产一线，无需昂贵仪器设备和专业标准实验室，对非洲猪瘟早期监测诊断与防控具有重要意义。

本发明的目的是提供一种检测效果最理想、灵敏度精准度最高的用于非洲猪瘟病毒检测的crRNA。

本发明另一目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a系统。

本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法。

本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的试纸条。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：