[发明专利]一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法

权利要求书

1.一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数为80-200万/mL；

S2、奶牛血清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；

S3、奶牛乳汁中乳清的提取及促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛的乳汁，然后提取乳汁中的乳清，将采好的乳汁用3000转的速度离心20分钟，收集上清液并应用ELISA法检测乳清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达；

S4、CCK8实验

将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞0.5×10⁴个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO₂的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度；

S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验

将0.3×10⁵个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、1μg/mlLPS组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，正常组不添加任何成分，烟酸组仅添加烟酸，1μg/mlLPS组仅添加1μg/ml LPS，LPS+烟酸组按照实验步骤分别添加烟酸和LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法测量细胞中的总蛋白含量，统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达；

S6、烟酸对GPR109A的激活作用

将0.3×10⁵个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。

2.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均匀，然后放置于65℃温水溶液中进行3min加热，再添加0.6g甲基蓝，最后放置于温度调整为4℃的冰箱中2小时，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存；再取一块干净的载玻片，滴入10μL的生鲜乳样品，放入恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。

3.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：血液中血清的提取方法为：将步骤S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中1小时，然后用3000转的速度离心5分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。

4.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体用于制备治疗奶牛乳腺炎药物的应用，其特征在于：乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相对表达量。