[发明专利]一种葡萄抗体库的制备方法

说明书

本发明提供了一种葡萄抗体库的制备方法，包括以下步骤：提取葡萄蛋白抗原，将获得的蛋白抗原对小鼠进行免疫；将免疫小鼠的脾脏及淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，获得杂交瘤细胞，并制备抗体；将获得的抗体点制在芯片上，获得葡萄抗体芯片；对获得的葡萄抗体芯片进行筛选，通过数据分析获得靶向所述葡萄蛋白质芯片上固定的蛋白质的富集的特异性抗体库。本发明首次利用蛋白组制备了覆盖葡萄果皮、叶片、果实、核的抗体库；发明中获得抗体的方法通量高，获得了2000多个抗体，单个抗体成本低，效率高；本发明中制备抗体的质量好，可以满足western blot和IP实验的要求，可以直接在实验中应用。

技术领域

本发明属于葡萄蛋白抗体研究领域，具体提供了一种葡萄高通量全蛋白组的抗体制备方法。

背景技术

葡萄(Vitis vinifera L.)属于葡萄科葡萄属浆果，它是我国第二大栽培果树，可以广泛地应用于酿酒、鲜食、制汁、制干。但是由于葡萄是多年生的杂合度高的果树，在分子生物学方面的研究较为滞后。随着葡萄基因组测序的完成，葡萄的研究进入了后基因组时代，大量的基因被注释和挖掘，其蛋白水平的研究越来越引起研究者的重视，抗体是研究蛋白功能的必须手段，但是由于葡萄抗体数量少，质量差，制备造价高，严重阻碍了葡萄蛋白功能的研究。

本发明的抗体制备方法成功克服了葡萄抗体制备的技术瓶颈，利用核心技术制备了覆盖葡萄花、叶、果实等重要器官蛋白的20000个抗体，并包含6000-7000个单克隆抗体，能够满足重要性状的蛋白功能研究。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种葡萄高通量全蛋白组的抗体制备方法，本发明提供了葡萄研究中的抗体芯片，可利用该芯片研究葡萄的重要形状，本发明的抗体芯片其包括来源与葡萄的花、叶、果实、等部位的抗性蛋白，共包含了20000个抗体，铺盖面较广。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种葡萄抗体库的制备方法，包括以下步骤：

(1)从葡萄中提取蛋白抗原，制得葡萄建库蛋白样本；

(2)将获得的蛋白抗原对小鼠进行免疫，免疫小鼠的脾脏及淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，获得杂交瘤细胞，并制备抗体；

(3)将获得的抗体点制在芯片上，获得葡萄抗体芯片；

(4)对获得的葡萄抗体芯片进行筛选，通过数据分析获得靶向所述葡萄蛋白质芯片上固定的蛋白质的富集的特异性抗体库。

上述方法中，所述步骤(1)中葡萄蛋白抗原来源与葡萄的器官，包括葡萄的皮、核、叶和果实。

上述方法中，所述步骤(1)中提取葡萄蛋白抗原的方法，包括以下步骤：通过SDS-PAGE分离葡萄蛋白样品，通过考马斯亮蓝染色对蛋白提取质量进行评估，提取的蛋白浓度大于20％为合格。

上述方法中，所述步骤(2)中制备抗体的方法，包括以下步骤：

(1)采用多点皮下注射免疫小鼠，四次常规免疫加一次冲击免疫；

(2)采用Western blot和ELISA检测并评估免疫小鼠血清中的抗体以及抗体效价；

(3)培养合格小鼠全脾和淋巴结与骨髓瘤SP2/0细胞系融合的融合细胞，取其细胞培养上清，ELISA检测融合效果；

(4)随机抽取融合细胞上清进行检测，得到IgG浓度分布，以细胞培养板上95％以上细胞株的上清IgG浓度≥5ug/ml作为合格建株杂交瘤细胞；

(5)将合格的建株杂交瘤细胞悬液注射进小鼠腹腔用于抗体生产，用产生的腹水提取抗体。