[发明专利]一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产L‑乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME‑BC，利用其发酵生产L‑乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME‑BC中D‑乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME‑BCM，其发酵生产L‑乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

技术领域

本发明涉及一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

乳酸(Lactic acid)，学名α-羟基丙酸，分子式为C₃H₆O₃，是世界上公认的三大有机酸之一。L-乳酸在食品、医药、农业、化妆品等众多领域有着广泛的应用，特别是高光学纯度的L-乳酸，L-乳酸聚合而成的聚乳酸因其有生物降解性和生物相容性而被广泛用于生产可生物降解塑料。20世纪80年代，我国约有50多家小乳酸厂，数年来，随着市场竞争逐渐淘汰至10家左右，年产能合计约20万吨。但近两年，随着聚乳酸生产技术的进步及下游应用领域开拓所带来的巨大市场空间，行业内企业及新进入者开始看好乳酸行业未来发展前景，先后投资建厂以扩大乳酸产能。

微生物发酵已成为乳酸生产最成熟的方法。微生物发酵具有产量高、产品纯度高、反应条件温和、不受任何环境污染等优点。微生物发酵原料通常是葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉等。发酵所用菌种主要包括芽孢杆菌、乳杆菌、根霉、曲霉以及工程菌株。传统乳酸发酵采用的菌种主要为乳酸菌和米根霉等。乳酸菌发酵生产L-乳酸多为同型发酵，具有较高的转化率，因而成为主要的工业菌种，针对乳酸菌的基因工程改造工作也取得了长足的发展。

嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物，具有较高的糖酸转化率。由于嗜热芽孢杆菌可以在45～60℃正常生长，对营养成分要求不高，极大地减少了发酵过程中污染杂菌的可能，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作。

目前，虽然凝结芽孢杆菌发酵产L-乳酸的研究很多，但是大多数凝结芽孢杆菌尚无可成熟的基因操作系统，进行遗传操作的菌株并不常见。关于可在凝结芽孢杆菌中自主复制质粒的报道很少，而且菌株电转化及敲除等遗传操作效率并不高。现报道只有两种凝结芽孢杆菌DSMl和P4-102B可以接受外源DNA电转化、基因敲除等遗传操作，但是这两株菌发酵生产L-乳酸产率很低，其中Sun LF等人利用凝结芽孢杆菌DSMl以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃条件下，发酵24h，乳酸产量仅为49.4g/L，产物的光学纯度为99.8％，产率达2.06g/L/h(Scientific reports,2016,6:37916)；Wang QZ利用凝结芽孢杆菌P4-102B以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃下发酵48h获得光学纯度100％的L-乳酸，L-乳酸产量仅为336.4mM(30.3g/L)，葡萄糖得率为0.89g/g(PNAS,2011,108(47):18920-18925.)。因此，无法满足工业上生产L-乳酸的需求。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)FMME-BC，利用其发酵生产L-乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME-BC中D-乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME-BCM，其发酵生产L-乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

本发明的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明的第二个目的是提供所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的感受态细胞。