[发明专利]一种新型烟粉虱若虫RNA干扰方法构建

说明书

本发明公开了一种烟粉虱若虫体壁渗透法RNA干扰的方法，包括如下步骤：1）棉花苗的培育；2）接虫产卵；3）采用体壁渗透法进行RNA干扰：准备好的dsRNA和外源对照基因dsEGFP，以1：1的体积比将星型聚合物的纳米材料和dsRNA混匀，小心地滴在若虫上，待液滴被虫体吸收后将棉叶插回装有清水的瓶中，放入培养箱中继续饲养，2天后记录死亡数并收集若虫样本。本发明方法利用新型纳米材料的强渗透性，使得dsRNA经体壁快速渗透进烟粉虱体内，显著降低了死亡率，提高了干扰效率，具有很高的时效性和良好的重复性。此外，本发明方法所用到的dsRNA量非常少，约0.3μl/头，在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种新型烟粉虱若虫RNA干扰方法构建。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci属于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，作为一种世界性的农业害虫，广泛分布于中国、日本、马来西亚、印度、美国等国。烟粉虱是一个快速进化的复合种，B烟粉虱于1949年首次传入我国，并于20世纪90年代暴发成灾，给我国农业生产带来巨大经济损失。Q烟粉虱于2003年首次在我国云南省被发现，目前Q烟粉虱已取代B烟粉虱成为我国主要危害种。烟粉虱属多食性害虫，寄主谱广，其寄主植物涉及74科420种，主要包括十字花科、葫芦科、豆科、茄科等。它对寄主植物的危害包括直接取食植物汁液，造成植株衰弱；分泌蜜露，诱发煤污病；作为植物病毒载体，传播植物病毒病。鉴于烟粉虱危害的严重性，对它的防治工作已经到了刻不容缓的地步。传统的防治方法多采用化学防治，而长期依赖化学杀虫剂，势必导致烟粉虱抗性的产生。在美国、西班牙、希腊等地已发现烟粉虱对吡虫啉产生严重的抗药性。而在我国浙江、江苏、湖北等地也已发现烟粉虱吡虫啉的中高抗品系。因此开展新防治方法的理论基础研究和应用基础研究势在必行。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物进化过程中一种高度保守的基因表达调节机制。它是由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)诱发的，特异性基因表达沉默现象。RNAi现象最早是在研究秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans反义RNA(antisense RNA)的过程中被发现，此后陆续在真菌、果蝇、拟南芥、昆虫、小鼠等多种真核生物中发现。它在真核生物中参与抵御病毒感染、抑制转座子活性、调控基因的表达，且在机体的发育调控及生理代谢方面具有重要的生物学意义。目前对昆虫进行RNAi的操作技术已经比较成熟，将dsRNA或siRNA导入昆虫体内主要有3种方法，即注射、饲喂和组织培养。注射法已成功应用于果蝇Drosophila、赤拟谷盗Tribolium castaneum、家蚕Bombyx mori、烟草天蛾Manducasexta、斜纹夜蛾Spodoptera litura、小菜蛾Plutella xylostella和棉铃虫Helicoverpaarmigera，也曾尝试用于烟粉虱的成虫，但其成活率仅有50％～60％。饲喂法已成功应用于长红锥蝽Rhodnius prolixus、棉铃虫和玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera，且在烟粉虱成虫RNAi中有较好的表现。组织培养法由于其培养条件难以掌握，目前仅在果蝇、白纹伊蚊Aedes albopictus和埃及伊蚊Aedes aegypti中有应用。

RNAi技术作为基因沉默的工具，被广泛应用于基因功能的研究，而且在农作物害虫防治方面展现出良好的应用前景，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。通过对棉铃虫幼虫饲喂表达P450基因(CYP6AE14)和谷胱甘肽基因GST1dsRNA的棉花，诱导RNAi并阻碍了幼虫发育，这一技术为田间害虫控制开辟了新领域；Baum及其同事利用含特定dsRNA的人工饲料饲喂玉米根萤叶甲，沉默了其14个特定基因，该RNAi为利用表达Bt毒素蛋白的玉米、棉花和大豆等作物来控制害虫，提供了一个独特的模式。RNAi应用于防治刺吸式的昆虫如半翅目蚜虫、叶蝉和粉虱同样具有极大的发展潜力。