[发明专利]一类腺依赖病毒病毒重组质粒、重组病毒及构建方法

说明书

本发明涉及一类5型腺依赖病毒重组病毒及生产方法，属于病毒改造及构建技术领域。本发明提供的5型腺依赖病毒重组病毒为：针对5型腺依赖病毒与腺依赖病毒受体(Adeno‑Associated Virus receptor，AAVR)的作用靶点区域氨基酸突变的5型腺依赖病毒(Adeno‑Associated Virus 5，AAV5)。本发明提供的腺依赖病毒重组病毒具有高纯度和高效价。(附图1)

技术领域

本发明涉及病毒生产技术领域，具体涉及一类腺依赖病毒重组病毒的重组方法。

背景技术

1型血清型腺依赖病毒(Adeno-Associated Virus serotype 5，AAV5)，属于细小病毒家族属中的一员。由于其可以广泛地感染人的不同组织、具有低免疫原性、天然条件下不致病等优点，已逐渐成为国际上用于基因治疗的优选病毒载体。已有文献报道通过全基因组功能损失的筛选，发现腺依赖病毒受体(Adeno-Associated Virus Receptor,AAVR)蛋白，是包含1型腺依赖病毒在内的多种血清型的腺依赖病毒入侵宿主细胞的必要受体。AAV5与AAVR的相互作用直接且特殊，这种相互作用需要AAV5结合到靶细胞上，AAV5的衣壳蛋白直接识别细胞表面的AAVR受体蛋白，AAV5的衣壳蛋白与AAVR受体蛋白的亲和度将影响病毒的感染效率。

在腺依赖病毒的基因治疗临床使用中，病毒的感染效率不足增加了病毒的使用剂量，从而既增加了成本，又增强了病毒过量带来的致死风险。

因此，发现从何种角度去增强病毒的感染效率变得十分紧迫。本发明立足于结构生物学手段，发现了AAV5与受体蛋白AAVR的相互作用位点，以及能够提高病毒感染效率的突变位点，从而为重组病毒的设计提供了依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一类腺依赖病毒病毒重组质粒、重组病毒及构建方法。本发明提供的1型腺依赖病毒重组病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

优选的是腺依赖病毒病毒衣壳VP1蛋白的第531位丝氨酸由Ser突变为Ala(S531A)。

本发明提供了一种腺依赖病毒重组病毒，所述腺依赖病毒重组病毒为：针对AAV5与AAVR的作用靶点区域氨基酸突变的腺依赖病毒。

本发明还提供了一类腺依赖病毒病毒重组质粒，所述腺依赖病毒重组质粒为负载上述技术方案所述腺依赖病毒重组病毒全长核苷酸序列的质粒。

优选的是，用于负载上述技术方案所述能够表达腺依赖病毒全长氨基酸序列的质粒包括pRC-AV5。

优选的是，所述能够表达腺依赖病毒全长氨基酸序列的未经突变的质粒，核苷酸全序列如SEQ ID NO.1,表达出的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒pRC-S531A的构建方法，包括以下步骤：

1)设计突变引物；

2)构建突变质粒pRC-S531A，经聚合酶链式反应、DMT酶切消化后，进行转化和提取鉴定以完成定点突变，得到含5型腺依赖病毒突变基因的重组质粒；

优选的是，步骤2)所述定点突变采用全式金公司快速定点突变试剂盒进行。

本发明还提供了上述技术方案所述腺依赖病毒重组病毒的包装方法，包括以下步骤：

将上述方法所构建的突变重组质粒，连同辅助质粒和基因组质粒共转染细胞，裂解细胞并纯化得到1型腺依赖病毒突变重组病毒。

优选的是，所述细胞包括但不限定于293T细胞。

优选的是，所述辅助质粒包括但不限定于pHelper。

优选的是，所述基因组质粒包括但不限定于pGFP。