[发明专利]双质粒系统及其应用

说明书

本发明提供了一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒命名为pCasAb，序列为SEQ ID NO：1；所述第二质粒命名为pSGAb，序列为SEQ ID NO：2。本发明能够高效、快速并且无痕地编辑鲍曼不动杆菌菌株的基因组DNA，包括基因插入、基因敲除和单碱基突变。所述的技术对于鲍曼不动杆菌的基因功能研究、耐药机制解析、新药物靶点筛选、新治疗方法开发等方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统及其应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌是一种危害性极大的革兰氏阴性人类病原细菌，能够引起一系列严重的医院获得性感染，如败血症、肺炎、心内膜炎和继发性脑膜炎等严重感染性疾病，且极易在患者、医护人员之间进行传播。鲍曼不动杆菌强大的致病和传播能力主要归因于两个方面。一方面，鲍曼不动杆菌具有耐受干燥和多种消毒剂的能力，使其能够在临床医疗材料表面长时间存活，难以被完全杀灭；另一方面，鲍曼不动杆菌能够摄取外源耐药基因，获得对包括碳青霉烯和多粘菌素类抗生素在内的多种抗生素的抵抗能力，其感染人体后很难找到有效的抗生素药物。近几十年来，随着抗生素的广泛使用，由多重耐药性甚至全耐药性鲍曼不动杆菌造成的临床感染病例正快速增加，进一步增加了治疗难度。在世界卫生组织(WHO)公布的抗生素耐药“重点病原体”清单中，碳青霉烯类耐药性鲍曼不动杆菌位列第一名，强调了新型药物靶点筛选和新型治疗方法开发的重要性和迫切性。

新型药物靶点的筛选离不开基因组层面的基因组编辑操作和后续的基因功能研究。用于鲍曼不动杆菌基因组编辑操作的现有技术主要有非复制许可质粒法和外源重组酶法。这两种方法的操作较为复杂，基因敲除效率较低，需要耗费大量的人力物力，且难以实现精确的无痕基因组编辑，极大地阻碍了鲍曼不动杆菌的基因功能研究，因此迫切需要开发一种适用于鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑系统。

CRISPR-Cas9系统是一种近年来开发的新型基因组编辑工具，具有强大的DNA定点切割能力。该系统源自原核生物的获得性免疫系统，是原核生物进化出来的一种用于抵抗外源核酸入侵和噬菌体感染的主动免疫系统。目前使用最为广泛的CRISPR-Cas9系统由来自化脓链球菌的Cas9核酸酶和人工嵌合单向导RNA(sgRNA)两部分组成。sgRNA能够与Cas9蛋白结合形成复合物，识别PAM位点上游能够与sgRNA的5’端的20bp spacer序列互补配对的靶标位点，并对其进行切割，造成DNA双链断裂。

CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组DNA产生双链断裂后，细菌只有通过同源重组修复DNA双链断裂才能存活。此时通过导入人工设计的同源修复模板，便可以通过同源重组修复，实现靶基因的精确定向编辑。然而，现行的CRISPR-Cas9系统还具有很大的局限性，不能直接用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，需要进一步探索和开发，才能实现鲍曼不动杆菌的高效率基因组编辑。

发明内容

鉴于现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于鲍曼不动杆菌基因组编辑的双质粒系统，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种双质粒系统，其特征在于，包含第一质粒与第二质粒，所述第一质粒能够表达Cas9蛋白和RecAb重组酶，所述第二质粒能够表达sgRNA。

优选地，所述第一质粒包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tacpromoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达。

更优选地，所述RecAb重组酶系统包含beta和exo基因片段。

优选地，所述第一质粒包含aprR阿布拉霉素抗性基因片段。

优选地，所述第一质粒包含sacB蔗糖筛选基因片段。