[发明专利]一种血清中含硫氨基酸的检测方法及其富集材料

说明书

本发明涉及一种血清中含硫氨基酸的检测方法及其富集材料，包括如下步骤：血清样品加入还原剂还原，还原后的血清样品溶液经过特异性净化材料前处理，得到净化的样品洗脱溶液，进液相色谱‑串联质谱检测分析，测定蛋氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸等含硫氨基酸的检测方法。特异性材料是以硅胶为基质的金属亲和材料，血清经过特异性材料净化，可以去除血清中基质的干扰，提高含硫氨基酸灵敏度，更好的保证含硫氨基酸检测的准确度。特异性材料的净化是利用含硫氨基酸的巯基与金属之间特异性的亲和作用，来实现对含硫氨基酸的选择性富集，解决含硫氨基酸在反相色谱无法有效富集的过程。

技术领域

本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种检测血清样品中蛋氨酸、半胱氨酸和同型半胱氨酸等含硫氨基酸的液相色谱-串联质谱的检测方法。

技术背景

人体内的含硫氨基酸与体内各种含硫化合物的代谢密切相关，蛋氨酸的缺乏会引起食欲减退、生长减缓、肾脏肿大等现象，可用于预防急性或慢性肝炎、肝硬化等疾病。半胱氨酸所带来的巯基可缓解有毒物质的中毒程度及防治放射线等。人体内还存在同型半胱氨酸，是甲硫氨酸在人体内的代谢中间的产物，同型半胱氨酸升高是动脉粥样硬化性血管病的危险因素[Jung YS,Y.et al,Biochimie.2013；95(8):1605-10]。临床检测人体含硫氨基酸，对于辅助诊断治疗临床患者相关疾病具有重要意义。临床检测含硫氨基酸方法有放射酶免疫分析法、荧光偏振免疫分析和高效液相色谱法等，酶免疫分析法灵敏度高特异性强，但精密度差、操作时间长不适合单个样本和急诊样本。荧光偏振免疫分析法使用成本较高且需要专门仪器设备。高效液相色谱法准确度稳定性较好，但不适合体内小分子物质痕量分析。液相色谱-串联质谱应用范围极广，灵敏度高、专属性强、能提供相对分子质量和结构信息，且在较高的准确度和精密度的前提下，做到高通量、定量时间短。普通的液相色谱-串联质谱检测血清中的含硫氨基酸时，血清样品中基质干扰较大，离子流色谱图基线干扰较多，对液相分离的色谱柱及质谱污染较为严重，所以设计对血清中含硫氨基酸特异性的富集净化材料，开发出针对血清中含硫氨基酸特检测的分离分析方法。[Ubbink JB,Y.et al,Semin Thromb Hemost.2000；26(3):233-41]。

近年来，定量分析复杂生物样本中氨基酸，根据氨基酸的结构性质利用离子交换固相萃取进行分离，使用简便、灵敏的高效液相色谱-串联质谱方法分析。由于质谱检测的特点，在色谱图上观察不到基质效应所带来其他干扰峰的影响，但固相萃取的共流出组分依旧会进入到色谱-质谱系统，污染色谱-质谱分离分析系统，降低质谱检测的灵敏度。例如，CN201710129265公开了一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法，其中在血浆样品中加入同位素内标溶液后，加入还原剂还原，进行沉淀蛋白处理后利用LC-MS/MS对上述上清液进行分析和采集，但是，所得精密度不高。又如，CN201610314061公开了一种用于内源性氨基酸检测的血浆样品前处理方法，采用硅胶键合的C1-30的烷基颗粒作为固体吸附剂吸附氨基酸成分，但是，对含硫氨基酸的特异性不高。针对含硫氨基酸的巯基的结构特点，设计开发一种针对血清中含硫氨基酸特异性富集纯化的固相萃取材料，以二氧化硅为基质，在合适的配位的基础上引入金属离子，其具有很好的亲和含硫氨基酸的特点，且十分稳定，有利于血清中含硫氨基酸的富集和纯化。实现含硫氨基酸的专属特异性。[Xinxing T,Y et al,Se Pu.2012,30(7):696-704]

发明内容

本发明的目的是提供一种血清中含硫氨基酸的检测方法及用于所述检测方法的特异性净化材料。所述特异性净化材料是以硅胶为基质的金属亲和材料，采用特异性的固相萃取材料对血清中的含硫氨基酸进行有效的富集净化，去除血清中基质的干扰，以实现简单、高效、可行的前处理过程及液相色谱-串联质谱的高灵敏度检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供的一种血清中含硫氨基酸的检测方法，包括以下步骤：

1)血清样本还原：取血清样本加入氘代内标，涡旋混合，加入还原剂还原，涡旋混合反应一段时间得到血清样品溶液，备用；