[发明专利]一种膀胱原代神经元的分离提取方法

说明书

本发明提供一种膀胱原代神经元的分离提取方法，涉及生物工程技术领域，本发明将膀胱体洗涤剪碎后，依次用二型胶原酶和胰蛋白酶进行消化，所得消化物细胞过滤后，将过滤液接种在神经元完全培养基中培养，从而分离得到膀胱原代神经元。本发明提供的方法通过对取材、消化和培养方面的优化，成功的从膀胱体中分理处膀胱原代神经元，能实现利用多种方法进行镜检鉴定，很好的保证了膀胱原代神经元的细胞活力，满足以大鼠膀胱原代神经元细胞为试验对象的试验需求。膀胱原代神经元的成功分离提取可为进一步展开膀胱神经源性病变的研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种膀胱原代神经元的分离提取方法。

背景技术

原代细胞培养也叫初代培养，是建立细胞系的第一步，其步骤包括取材、分离、培养和维持等步骤。培养原代细胞能够为生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，能够为传代培养创造条件，也是临床实践和药物筛选的必经步骤。

目前，膀胱的原代细胞培养有很多种，如膀胱癌原代细胞，膀胱原代成纤维细胞，膀胱原代平滑肌细胞，但是缺少膀胱原代神经元的提取与培养方面研究。这主要是因为膀胱组织中神经元数目较少，且膀胱神经元与平滑肌细胞、上皮细胞在一起，很难单独分离出膀胱神经元细胞，给研究工作带来很多困扰。而且，在膀胱取材、消化以及培养过程中通常会对神经元有损伤，使得培养时其他非神经元细胞生长占据优势从而抑制神经元的生长等情况，所以目前缺乏一种有效的膀胱原代神经元分离提取方法。

发明内容

本发明为了克服现有技术缺少一种膀胱原代神经元分离提取方法的缺陷，提供了一种膀胱原代神经元的分离提取方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种膀胱原代神经元的分离提取方法，包括以下步骤：

(1)取膀胱体，以无菌的克氏液洗涤后剪碎，得到预处理膀胱样品；

(2)以二型胶原酶消化预处理所述膀胱样品，离心弃去上清，得到第一消化物；

(3)以胰蛋白酶消化所述第一消化物3～7min，离心弃去上清，得到第二消化物；

(4)将第二消化物与神经元完全培养基混合，细胞过滤器过滤，将过滤液摇床培养20～40min后，离心弃去上清，所得沉淀以神经元完全培养基重悬后加入到预先包被有多聚-D-赖氨酸和层黏连蛋白的细胞爬片上培养4～7d，培养48h后全量换液，培养48～96h后再次全量换液；

所述神经元完全培养基以Neurobasal-A培养基为基础培养基，还包括：质量浓度1～3％的B-27型无血清添加剂、质量浓度0.2～2％的L-谷氨酰胺、质量浓度0.05～0.2％的GDNF和质量浓度1～5％的100×抗菌-抗真菌剂。

优选的，步骤(2)中，所述二型胶原酶的浓度为1～5mg/ml，二型胶原酶的体积与预处理膀胱样品的质量之比为1～5ml：1g。

优选的，步骤(2)中，所述二型胶原酶消化的时间为1～2min。

优选的，步骤(3)中，所述胰蛋白酶消化终止时，采用加入4℃缓冲液培养基的方式终止消化；

所述缓冲液培养基以F12培养基为基础培养基，还包括：质量浓度5～12％的胎牛血清和0.5～3％的100×抗菌-抗真菌剂。

优选的，步骤(3)中，所述缓冲液培养基的加入量为胰蛋白酶和第一消化物总体积的2倍以上。

优选的，所述细胞过滤器的内径为40～100μm。

优选的，步骤(2)、(3)中，所述消化在37℃、5％CO₂培养箱中摇床消化。