[发明专利]基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法在审
| 申请号： | 201910632746.7 | 申请日： | 2019-07-14 |
| 公开（公告）号： | CN110305909A | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 王全新 | 申请（专利权）人： | 辽宁长生生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027 |
| 代理公司： | 长沙睿翔专利代理事务所(普通合伙) 43237 | 代理人： | 周松华;孙建霞 |
| 地址： | 117004 辽宁*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 系统构建 小鼠模型 基因突变小鼠 受精卵 小鼠 制备 注射 基因工程领域 遗传工程小鼠 小鼠受精卵 基因打靶 位点序列 显微注射 性活动 杂合子 交配 雌鼠 构建 精子 可用 体外 移植 培育 | ||
本发明属于基因工程领域，具体涉及基于CRISPR‑Cas9系统构建不育小鼠模型的方法。本发明的基于CRISPR‑Cas9系统构建不育小鼠模型的方法，包括以下步骤：确定小鼠Piwil1基因打靶位点序列；制备gRNA；体外显微注射：收集小鼠受精卵，将gRNA和Cas9 RNA注射进入小鼠的受精卵，对注射的受精卵进行移植培育。本发明利用CRISPR‑Cas9系统构建了MIWI D633A基因突变小鼠，雄性杂合子性活动能力正常，有一定数量的精子，可与雌鼠交配，正常形成精栓，但可导致不育，本发明所构建的基因突变小鼠可用于遗传工程小鼠的制备。
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法。
背景技术
小鼠是临床医学研究中重要的模式动物之一，已广泛地应用在生命科学和生物医学的研究中。中国每年使用约1000万只以上。目前，基于小鼠的遗传工程技术主要通过假孕鼠移植异种受精卵。此技术需提前制备结扎公鼠，并测试结扎效果，方可使用。
Piwil1(piwi-like RNA-mediated gene silencing 1)是生殖细胞特异表达基因，主要在雄性生殖细胞中表达。PIWI蛋白质特异性地结合一类被称为piRNA的小分子非编码调控RNA，形成piRNA/PIWI功能复合物，通过沉默生殖系细胞中的转座元件及调控其它下游靶RNA分子，维持生殖细胞基因组稳定，为动物生殖细胞发育分化所必需。国内外研究证实，此基因突变可导致雄鼠不育。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法。
根据本发明具体实施方式的基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法，其方法包括以下步骤：
(1)确定小鼠Piwil1基因打靶序列；
(2)制备sgRNA；
(3)制备cas9mRNA；
(4)体外显微注射：收集小鼠受精卵，将gRNA和Cas9RNA注射进入小鼠的受精卵；
(5)对注射的受精卵进行移植培育。
根据本发明具体实施方式的基于CRISPR-Cas9系统构建不育小鼠模型的方法，步骤(1)中，小鼠Piwil1基因打靶位点序列如SEQ ID No.1所示，
SEQ ID No.1：
GTTACCATGACACCACAGCT
根据本发明的具体实施方式，野生型Piwil1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：
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