[发明专利]一种定量检测产土臭素菌株的标准品及制备、检测方法

说明书

本发明公开了一种定量检测产土臭素菌株的标准品及制备、检测方法，所述检测方法包括如下步骤：步骤一，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线，所述重组质粒为包含GSY基因的重组质粒或重组细胞，所述GSY基因的序列由125个脱氧核糖核苷酸组成，为序列表SEQ ID NO.1中的序列；步骤二，用待测样品替换步骤一中的标准品，进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中GSY基因的拷贝数，即得到所述待测样品中产土臭素菌株的数量，通过本发明，可实现水环境样品中产土臭素菌株的快速定量检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种定量检测产土臭素菌株的标准品及制备、检测方法。

背景技术

水体富营养化导致水体中藻类大量繁殖，蓝藻进入饮用水处理工艺后，影响水厂工艺的正常运行，导致滤池反冲频繁，增加水厂自用水量，其代谢产生嗅味物质会给饮用水带来相应的水质安全风险。其中，土臭素在饮用水嗅味问题中占有很大的比例，土臭素为饱和环醇类有机物，结构非常稳定，很难在自然界中降解，它们具有很好的水溶性和脂溶性，可通过水生生物的鳃、皮肤和摄食进入生物体内，在其脂肪中迅速富集，产生土腥味，不但影响人们的感官特征，甚至能对人的健康产生危害。对于敏感个体而言，其嗅味问题是1ng/L，远低于当前可用的分析设备的检测限制水平(2-3ng/L)。

常用的土臭素检测方法如感官分析法、气相色谱-串联质谱法等，但均无法支撑土臭素预警性检测体系的建立。如何利用现代生物技术手段，结合分子生物学方法，利用微生物生长过程中相关基因丰度变化与土臭素产生与累积之间的关联性，实现土臭素的预警和预测，对保证饮用水安全将是非常必要的。

由于GSY基因与土臭素合成密切相关，可以通过检测GSY基因的拷贝数来检测产土臭素菌株浓度，因此，本发明拟提供一种通过检测GSY基因的拷贝数来检测产土臭素菌株浓度的定量检测产土臭素菌株技术，以对地表水进行定量检测。

发明内容

为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种定量检测产土臭素菌株的标准品及制备、检测方法，以快速检测水环境中少量的产土臭素菌株，为预防嗅味物质爆发提供技术支持。

为达上述目的，本发明提出一种定量检测产土臭素菌株的标准品，所述标准品为包含GSY基因的重组质粒或重组细胞，所述GSY基因的序列由125个脱氧核糖核苷酸组成，为序列表SEQ IDNO.1中的序列。

优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

为达到上述目的，本发明还提供一种如前述标准品的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，针对GSY基因设计特异性的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3；

步骤二，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤三，以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤四，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤五，将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤六，选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜，并利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

优选地，于步骤六后，所述方法还包括：

将获得的大量质粒标准品用pH 8.0的1×TE缓冲液梯度稀释后，利用超微量核酸蛋白测定仪测定质粒标准品的浓度，计算质粒的拷贝数，计算后确定质粒标准品的拷贝数为6.11×10⁹copies/μL。