[发明专利]一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法

权利要求书

1.一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）使用碘伏消毒会阴部和尿道外口，采用导尿术采集不少于40 mL尿液至50 mL无酶无DNA离心管中，以防止外源性污染，将尿液放在置有冰袋的泡沫盒内于半小时内送至实验室；

2）将尿液放在高速低温离心机内离心1小时，于15000×g条件下离心，温度为4℃；

3）用5 mL移液枪及灭过菌的无菌枪头吸去大部分上清液，仅留下沉淀物及底部1.5 mL的上清液，利用移液枪将余留的上清液和沉淀物吹打混匀，并移至1.5 mL无菌离心管中；

4）将上述1.5 mL离心管置于高速离心机内，于20000×g条件下离心1小时，温度为4℃；

5）移去上清液，保留沉淀物，将250 µL细菌细胞裂解液加在沉淀物中，吹打混匀，直至无可见团块状物质为止；

6）将上一步样本置于60℃水浴箱中，水浴30分钟，然后移于液氮中，保持30分钟，此步骤循环不少于6次；

7）取上一步样本120 µL至PCR管，再加磁珠提取液60 µL，反复吹打混匀，掌上离心机离心30秒后将PCR管放置在磁力架上保持10分钟，吸去上清液，保留磁珠，掌上离心机离心30秒，再次吸去上清液；

8）在PCR管中加入磁珠洗脱液反复洗脱磁珠2次，吸去磁珠洗脱液，此步骤在磁力架上进行，掌上离心机离心30秒，再将PCR管置于磁力架上，吸去洗脱液；

9）加30 µL无菌去离子水至PCR管中，反复吹打混匀，直至无可见磁珠，此步骤不可在磁力架上进行；

10）将上一步样本置于磁力架上，静置10分钟，吸去上清液，即DNA；

11）对细菌16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增并对产物进行DNA电泳检测。

2.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，从步骤2开始之后的所有操作均在生物净化台内完成。

3.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤8中所用的磁珠洗脱液为80%乙醇+3%盐酸的混合溶液。

4.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤7中吸去上清液的过程中枪头不可触碰磁珠。

5. 如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤11中进行PCR扩增的引物为515F和806R，PCR反应体系50 µL ，包括PCR Mix Buffer 25 µL，DMSO 3 µL，F/R引物各3 µL，gDNA 10 µL，去离心水6 µL，PCR反应条件为：98℃预变性30 s→98℃变性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸15 s，变性-延伸循环反应30次→72℃终延伸1min→4℃保温。