[发明专利]一种在体外维持造血干细胞自我更新能力的细胞因子组合

说明书

本发明公开了一种可以体外扩增小鼠造血干细胞(HSCs)的关键细胞因子组合，包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素‑12(IL‑12)，优化了无血清培养体系并分型纯化了HSCs细胞，成功实现了HSCs体外扩增后移植的高水平的重建，连续移植后更加突显出该因子组合对HSCs自我更新能力的维持和扩增后的重建优势。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及HSCs的体外扩增方法，尤其是在优化的无血清培养基上添加特定细胞因子后，体外培养小鼠HSCs一段时间后与一定比例的竞争细胞共同移植，结果显示明显的重建优势，从而证实了该因子组合对HSCs体外功能性扩增的作用。

背景技术

随着医疗技术的不断发展与进步，干细胞成为再生医学的“主力军”。造血干细胞(HSCs)作为目前研究最为透彻的成体干细胞类群之一，在临床上广泛应用于多种造血系统恶性疾病、自身免疫性疾病的治疗。随着HSCs移植策略和移植方案的不断更新和改进，特别是半倍体移植的实施解决了供体来源短缺的瓶颈问题后，临床移植效果取得了长足的进步。但是HSCs的体外特性的维持甚至数量扩增对于进一步改善预处理方案和减少预处理损伤、脐带血HSCs移植和HSCs基因治疗方面仍然具有重要的临床意义。因此如何在体外建立HSCs的培养和扩增体系也成为困扰基础研究和临床应用的世界性难题。

HSCs以其两个特性而被熟知，即自我更新和多向分化的能力，这两者之间的平衡维持着机体血液系统的稳态。研究发现体内稳态环境中，HSCs大部分是处于静息状态的，一旦HSCs被放置于体外环境中则即刻进入细胞周期而丢失干性，干性丢失将严重影响临床的治疗效果。现有的HSCs体外培养和扩增体系主要是以无血清培养基为基础、添加多种细胞因子和小分子化合物的“鸡尾酒”样培养体系，HSCs在大多数现有的培养体系中趋于快速分裂，而细胞的快速分裂往往伴随细胞干性的丢失。同时，随着单细胞技术的不断发展与应用，HSCs的异质性也随之凸显，这为实验结果的重复也带来了困难。

众所周知，HSCs静息状态的维持与其功能特性息息相关。而细胞因子在调节HSCs进入细胞周期进而分裂增殖过程中发挥着重要作用。研究发现IL-3，IL-6，IL-11，血小板生成素(TPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与干细胞因字(SCF)结合使用时可以使HSCs进入细胞周期。但是可以体外在维持HSCs干性的基础上实现扩增的最佳细胞因子组合并不清楚。

发明内容

本发明针对HSCs体外培养干性丢失的问题，筛选出了可以体外维持HSCs干性的细胞因子，进一步优化建立了一整套无血清培养体系，并对HSCs进行了进一步的纯化。这种方法明显提高了HSCs在连续移植的受体小鼠体内的重建比例，由于培养基中各种成分明确，操作简便，重复性高，细胞因子组合简单，为临床HSCs的体外自我更新能力的维持和数量扩增提供了新的思路。

本发明首先提供了一种在体外维持HSCs自我更新能力的细胞因子组合，包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-12(IL-12)，所述各细胞因子的浓度各自独立选自25-100ng/ml，优选为50ng/ml。

本发明还提供了一种在体外维持HSCs自我更新能力的培养体系，包括基础无血清培养体系以及上述细胞因子组合，所述基础无血清培养体系包括基础培养基F-12，胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)，β-巯基乙醇(β-Me)，L-谷氨酰胺(L-Glu)，非必需氨基酸(Non-essential amino acid，Non-eaa)，HEPES液，青霉素和/或链霉素(P和/或S)，重组人血清白蛋白(r-HSA)。