[发明专利]粉棒束孢Kill Protion4基因、重组蛋白及应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢Kill Protion4基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。本发明从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY‑2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出2条粉棒束孢Kill Protion4基因，命名为Ifkp4‑1和Ifkp4‑2，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组KP4蛋白等，并通过构建Ifkp4‑1基因敲除与回复株验证该基因的功能。本发明得到的重组KP4蛋白性质稳定，产量和纯度较高，并具有广谱杀真菌效力和药理活性，还能显著增强植株的抗逆性能，有潜力开发成为生防制剂、抗菌药品、保健产品等。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢的重组Kill Protion4基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。

背景技术

粉棒束孢(Isaria farinosa)，是丝状真菌棒束孢属(Isaria Fries)模式种，是一种主要的昆虫病原真菌，同时也是一种极具开发价值和商业利用价值的真菌，具体表现在：1)现有研究表明，粉棒束孢对多种类型的害虫具有良好的杀虫效果；2)粉棒束孢作为蝙蝠蛾幼虫的定殖真菌，其药用活性也越来越多地被研究和发现；3)已从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到包括多糖、虫草酸、生物碱、吡啶酮、天然苯腙、喹唑啉酮、环状五肽、蒽醌类化合物等多种新化合物；4)研究证明粉棒束孢菌的代谢产物中具有类似生长素和细胞分裂素的物质等。然而目前针对粉棒束孢的研究主流还停留在宏观层面上，主要以粉棒束孢的代谢产物或孢子悬液或菌丝体作为研究对象，其微观分子层面的研究才刚刚起步，且现有的利用分子生物学手段对粉棒束孢进行的深入和系统研究，主要都集中在真菌分类及作为生防菌的角度进行。

申请号为201610476131.6的发明专利公开了一株粉棒束孢的发酵培养物在制备预防林业害虫的生防制剂中的应用，该发明主要是利用了菌株的发酵培养液。杨俊媛等学者从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到多种有价值的化合物，但其研究依然停留在宏观层面。因此，有必要在全面、系统研究活性代谢产物的基础上深入开展粉棒束孢药理活性与基因功能之间的关系，以便构建出能够产生特定活性成分的超级生产菌株。

KP4蛋白是由玉米黑穗病病毒UMV4产生的一种多肽片段，大量研究已表明kp4基因及其分泌的KP4蛋白能影响真菌的生长。

本发明团队前期在培养过程中发现，粉棒束孢FTRSY-2菌株对一些真菌具有明显的抑制作用，因此推测是否由于粉棒束孢FTRSY-2能分泌某些毒素蛋白或产生某些次级代谢产物才导致对某些病原菌出现抑制现象。鉴于此，本发明从粉棒束孢基因组中分析发现了两条与编码真菌毒素(Kill Protion4)KP4蛋白相似的基因，并首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢KP4基因，命名为Ifkp4-1和Ifkp4-2。以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组KP4蛋白等，并通过构建Ifkp4-1基因敲除与回复株验证该基因的功能。为进一步研究粉棒束孢功能基因及其潜在的药用价值奠定了基础，具有重要的研究意义和潜在的商业价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一，在于提供一种粉棒束孢Kill Protion4基因。

粉棒束孢的Kill Protion4基因，所述的Kill Protion4基因核苷酸序列包括SEQID NO.1所示和/或其中的片段；所述Kill Protion4基因核苷酸序列还包括SEQ ID NO.2所示和/或其中的片段。该基因由本发明的课题组首次从粉棒束孢基因组中克隆得到，命名为Ifkp4。

本发明的目的之二，在于提供上述粉棒束孢Kill Protion4基因的制备方法。