[发明专利]一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法

说明书

本发明公开了一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，包括步骤：制备实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品；制备发光细菌菌液；将发光细菌菌液加到96孔细胞培养板中，然后置于酶标仪，30min后测定初始光密度值和初始生物发光值；向发光细菌菌液中加入实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品，前1h每30min测一次光密度值和生物发光值，随后每1h测一次，测试不低于24h；获取光密度突变时间和生物发光突变时间；计算急性发光抑制率、慢性发光抑制率和生长抑制率。本发明可同时评估待测物质对发光细菌的生长作用、急性和慢性毒性效应，准确率高，实现了毒性测试的高通量化，测试效率高。

技术领域

本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法。

背景技术

发光细菌是一种在正常新陈代谢过程中可自发蓝绿色光的化能自养型微生物，发光主要依靠由NAD(P)H：FMN氧化还原酶以及荧光素酶组成的生物发光酶系统，发光强度与细胞内新陈代谢紧密相连，当发光细菌的活性较高时，细胞新陈代谢ATP含量较高，发光则较强。反之，如果发光细菌受到某些因素影响细胞活性被抑制，ATP含量则会响应并随之下降，从而导致发光细菌的发光变弱，甚至停止发光。传统的发光细菌毒性实验则根据此原理，通过检测发光细菌的发光强度，并与空白组做比较，表征被检测物质的毒性。

传统的发光细菌毒性实验常被应用于环境污染监测，如发明专利申请一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法(申请号为201710407732.6，公布号为CN 107238599A)，包括步骤：对土壤样品进行预处理；称取土样，过尼龙筛后用甲醇索氏提取，减压旋转蒸发浓缩，加入乙二醇后将该混合物继续浓缩备用；取培养后的发光细菌培养液，加入样品浸提液、15wt.％NaCl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度；样品毒性的表达：测量静置后混合液的发光抑制率、氯化汞当量浓度；如发明专利利用淡水发光细菌检测铜污染土壤急性毒性的方法(申请号为200910079402.4，授权公告号为CN 101487798 B)，具体方法选用淡水发光细菌作为检测用细菌，包括以下步骤：第一步用土壤背景溶液制备淡水发光细菌的菌悬液；第二步采用双室离心法提取土壤孔隙水；第三步检测土壤样品的毒性。

但是目前的发光细菌毒性检测方法通常只有急性(5～30min)发光毒性检测这一个毒理学端点，只能评估待测物质对发光细菌的发光作用的急性效应，从而忽略物质对发光细菌造成的延迟毒性作用，或者发光作用之外的效应，如生长作用。此外，现有的细菌毒性检测方法是使用发光仪测试发光强度，评估方式单一，且每次所测样品数量有限，测试效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，同时评估待测物质对发光细菌的生长作用、急性和慢性毒性效应，准确率高，实现了毒性测试的高通量化，测试效率高。

本发明提供了如下的技术方案：

一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，包括以下步骤：

制备若干不同浓度的实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品；

在无菌条件下制备发光细菌菌液；

将所述发光细菌菌液加入到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于酶标仪中，30min后测定初始光密度值和初始生物发光值；

向发光细菌菌液中加入实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品，前1h每30min测一次光密度值和生物发光值，随后每1h测一次，测试不低于24h，测试过程中每5～10min振动一次96孔细胞培养板；

做出阴性对照样品的光密度值和生物发光值随时间变化曲线，分别获得光密度突变时间和生物发光突变时间；