[发明专利]一种BTV1 VP2蛋白的原核表达制备方法

说明书

本申请属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术制备BTV1（蓝舌病1型病毒）VP2蛋白的制备方法专利申请事宜。蓝舌病1型病毒VP2蛋白基因编码序列VP2U由2886bp碱基组成，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。具体原核表达制备BTV1 VP2蛋白时，包括：PCR扩增，酶切、与质粒pET28连接构建重组质粒pET28‑VP2U，转化，诱导表达等步骤。本申请通过对相关编码基因的优化，进一步借助于原核表达系统的技术优势，为发酵制备BTV1 VP2蛋白奠定了一定技术基础。初步实验结果表明，发酵液上清中的目的蛋白表达量可达到58.4μg/ml，可为工业化生产奠定良好技术基础。

技术领域

本申请属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术制备BTV1（蓝舌病1型病毒）VP2蛋白的制备方法专利申请事宜。

背景技术

蓝舌病（Bluetougue，BT）是一种由蓝舌病毒（bluetongue virus，BTV）以库蠓、伊蚊等昆虫为媒介，严重感染反刍动物的烈性传染病，这种病毒主要侵害反刍类牲畜，可以引发高热、抑郁以及口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化等症状，已被国际动物卫生组织（OIE）定义为法定报告的传染病，我国农业部也已将该病定为一类动物疫病。基于上述发病原因，可以看出：蓝舌病的发生和分布与媒介昆虫的分布有密切关系，主要暴发于库蠓大量活动的夏秋季节，特别多见于低洼潮湿多水区域，而且主要发生在热带和亚热带。目前，蓝舌病给全球的养殖产业带来了严重的威胁，引起了世界相关人士的高度重视。

研究表明，BTV属于呼肠弧病毒科环状病毒属蓝舌病病毒亚群，有27种血清型，各血清型间无交叉保护。到目前为止， 已经有7个血清型（BTV1、BTV2、BTV3、BTV4、BTV12、BTV15、BTV16）在我国被发现。其中BTV1 和BTV16 在中国流行最广。BTV基因组约19218bp，分子量1.3×10⁷，为分子质量最大的RNA病毒，基因组为10 个节段的双链RNA，其中4 个小片段（S7-S10）、3 个中片段（M4-M6）、3 个大片段（L1-L3），节段基因组分别编码3 个非结构蛋白（NS1-NS3）、7 个结构蛋白（VP1-VP7）。

完整的BTV粒子呈二十面体对称结构，无囊膜。BTV 具有双层蛋白衣壳，L2和M5基因编码的VP2和VP5是构成 BTV外壳的主要成分，病毒内壳即核心衣壳主要由L3和S7编码的主要结构蛋白VP3和VP7和次要结构蛋白VP1、VP4、VP6构成，与BTV病毒的复制有关。在BTV的外壳有60个类似三角状的VP2三聚体凸起，外周围绕着120个VP5的球状三聚体，即膜穿透蛋白，中层有260 个VP7三聚体构成，内层包含几乎完全被VP7 层包裹的120个 VP3 单体。

的VP2蛋白由L2基因编码，含956个氨基酸，大小约110 kDa，是病毒的主要型特异性抗原和血凝素蛋白，与病毒的毒力、受体结合、细胞吸附作用和畜主特异性免疫有关VP2与中和抗体的产生有关，是BTV血清型特异性蛋白；BTV有血凝素，可凝集绵羊及人的O型红细胞，其血凝活性与VP2有关，血凝抑制试验可用于BTV分型。而VP5蛋白能增强中和抗体的产生，因此能够提高疫苗的效力；VP3和VP7蛋白较为保守，均具有BTV抗原决定簇，对BTV内部结构的稳定具有重要作用。

目前，防控蓝舌病的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗等等。其中，弱毒疫苗能刺激机体产生强大的保护性免疫应答，但也可能引起一些副反应：如在妊娠期使用会致畸和流产，降低泌乳动物产量，产生病毒血症等，同时还存在毒力返强的风险。基因工程亚单位疫苗具有安全、廉价、可适用于多种血清型的优点，有很好的应用前景，但目前基因工程亚单位疫苗还处于研究阶段。而VP2蛋白是BTV的主要型特异性抗原和血凝素蛋白，是BTV亚单位疫苗研究的主要靶标，因此，生产和科研上均迫切需要大量制备BTVVP2 蛋白。