[发明专利]一种用于几丁寡糖制备的几丁质酶及其基因

说明书

本发明提供一种用于几丁寡糖制备的几丁质酶及其基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述几丁质酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；含所述基因的重组载体是几丁质酶基因连接至大肠杆菌质粒或酵母质粒；所述基因的细胞由所述重组载体转化而得；所述含几丁质酶基因的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的大肠杆菌或包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的毕氏酵母。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于几丁寡糖制备的几丁质酶及其基因。

技术背景

海洋环境可以提供有巨大应用潜力的新的化合物，比如具有潜在市场价值的酶，尽管海洋环境中不断产生着甲壳类废物，但是在海洋沉积物中却是鲜有见到。这些现象说明在海洋环境中广泛分布着丰富的产几丁质酶的微生物，这些来源于海洋环境的微生物产生的几丁质酶将几丁质水解，完成自然界对几丁质的加工。据报道，海洋细菌Alteromonassp. strain 0-7，Micrococcus sp. AG84，Pseudoalteromonas sp. DL-6 ，Vibriofurnissii ，Aeromonas caviae和Pseudoalteromonas sp. DXK012可以将几丁质降解为几丁寡糖供其代谢或被其他微生物作为唯一的碳氮来源。除此之外，从韩国济州岛沿海地区的苔藓虫分离得到的Vibrio sp. 98CJ11027产生的外切几丁质酶被纯化后用来生产几丁二糖。据报道，有一些细菌，包括Acinetobacter ASK18，Alcaligenes faecalis AU02，Vibrio(Aestuarianus，Flavobacterium，Shewenella and Exiguobacterium)等都是从海洋废弃物、沿海地区沉积土壤、海产品工业废水和甲壳类废物中分离得到的，这些环境样品都是几丁质酶的主要来源。

几丁质（Chitin）又叫甲壳素、甲壳质、蟹壳素或明角壳蛋白，是存在于自然界中除纤维素之外的第二大类丰富的多糖，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物，不溶于水和绝大多数有机溶剂，溶于浓盐酸和浓硫酸，是真菌细胞壁，昆虫外骨骼和甲壳动物壳的主要结构成分。几丁质酶（Chitinase，EC 3.2.2.14）是糖基水解酶，其特征在于水解几丁质链中的N-乙酰氨基葡萄糖的β-1,4糖苷键。几丁质酶的最适pH值一般为1.0-8.0，等电点为3.1-10.0。大多数几丁质酶的最适反应温度为40-60°C，热稳定性良好，一般在40-60°C条件下较为稳定。许多金属离子尤其是重金属离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Co2+和Fe3+等对几丁质酶活力有不同程度的影响。根据氨基酸序列保守型，几丁质酶分属于18，19，和20家族糖苷水解酶。根据细菌几丁质酶催化结构域的相似性，将18家族几丁质酶进一步划分为A、B、C三个亚家族。亚家族A几丁质酶的催化结构域中包含一段几丁质酶插入结构域（CID），是亚家族A的主要结构特征。

几丁质酶是专一降解几丁质为几丁寡糖或单糖的一组酶的总称，根据其作用的部位分为外切几丁质酶和内切几丁质酶。外切几丁质酶一般又分为几丁二糖酶和N-乙酰基葡糖苷酶，内切几丁质酶随机水解几丁质链生成几丁寡糖（GlcNAc）n，n2。几丁二糖酶水解几丁质多糖链的一端或几丁寡糖生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖二聚体(GlcNAc)2，N-乙酰基葡糖苷酶则可以水解几丁质多糖链的一端或(GlcNAc)2生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GLcNAc）单体。