[发明专利]生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法

说明书

本发明公开了一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，包括下列步骤：（一）DNA合成及重组菌构建；（二）生物电催化系统电池装置的预处理；（三）P450酶生物电催化系统的组装；（四）样品的提取、处理及检测方法；（五）生物量的测定；（六）胞内NAD(H/+)、NADP(H/+)比值测定。本发明向P450酶全细胞催化系统中引入体外电子传递途径（EET途径）驱动NAD(P)H再生，结合了电化学和P450酶全细胞催化系统，实现了碳源电子供体和电极电子供体对P450介导的单加氧反应的协同驱动作用，即为细胞色素P450酶生物电催化系统。本发明以CYP7B1的全细胞转化系统为基础，DHEA（I）、7α‑OH‑DHEA（II）分别为该羟化反应的底物和产物，为P450介导的单加氧反应在甾体工业上的发展提供良好的借鉴。

技术领域

本发明涉及一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

甾体药物被广泛用于抗炎、抗癌、抗过敏以及避孕药等，是未来全球药物市场上最具有影响力的药物种类之一。甾体母核的羟基化反应是赋予甾体特殊生理药理活性的重要方式之一，在甾体工业上常见的反应有C7α,C9α,C11α,C11β,C16α,C17α羟基化等。然而这些羟基化反应的完成对于传统的化学合成工艺是巨大的挑战，因此由细胞色素P450单加氧酶介导的微生物转化是甾体工业上生产药物中间体的最重要手段之一。利用微生物转化法合成甾体化合物，专一性强，立体选择性较高，并且副产物少，弥补了化学合成法的不足之处；同时，微生物转化条件温和，步骤简单，避免了大量有机溶剂和化工原料的使用，因此微生物转化过程是一个环境友好型绿色过程。由于P450催化的甾体羟基化反应需要大量还原型辅酶提供电子，即为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷酸化形式(NADPH)，因此还原辅酶或还原力的供给是甾体中间体生物合成的重要限制性因素。为了促进NAD(P)H的有效再生，大多研究主要基于两种策略，一是引入辅助的酶催化的辅酶再生系统，或改变与NAD(P)H相关的代谢路径，促使更多的电子流再生还原力。例如，Tsuyoshi等人将甘油脱氢酶(GLD)与P450cam在大肠杆菌中共表达，显著提高了产物5-exo-hydroxycampor的产量。除此之外，乙醇脱氢酶(ADH)、甲酸脱氢酶(FDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)也被相关文献报道，可被引入生物催化剂中进行NADH或NADPH的原位再生过程，以促进相应需要还原辅酶的反应进行。另外，Arnold和其工作者通过改造与NAD(P)H有关的代谢路径，使得宿主内部部分呼吸链失活，调整了体内辅酶的还原型与氧化型之间的比例，从而显著促进了P450_PMOR2催化的单加氧反应。

发明内容

目前涉及相关P450酶系的催化工程，多采用基因工程改造后微生物的全细胞催化。然而对于需要大量电子供体的细胞色素P450单加氧酶来说，还原力供给不足仍是限制大多数甾体羟基化反应的实际应用的重要因素。为了进一步解决甾体羟化过程中还原力供给不足的问题，本发明向P450酶全细胞催化系统中引入体外电子传递途径(EET途径)驱动NAD(P)H再生，结合了电化学和P450酶全细胞催化系统，实现了碳源电子供体和电极电子供体对P450介导的单加氧反应的协同驱动作用，即为细胞色素P450酶生物电催化系统。本发明以CYP7B1(7α羟化酶)的全细胞转化系统为例，DHEA(I)、7α-OH-DHEA(II)分别为该羟化反应的底物和产物(如图2)，为P450介导的单加氧反应在甾体工业上的发展和改良提供了良好的借鉴。

本发明所要解决的技术问题是提供一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的生物电催化系统促进P450酶单加氧反应的方法，包括下列步骤：

(一)DNA合成及重组菌构建

从NCBI数据库中获得(NP_031851.3)来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，由北京擎科生物公司密码子优化后合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；