[发明专利]一种基于人源TLR4基因的多功能双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于人源TLR4基因的多功能双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。本发明多功能双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/‑3494+235/3UTR，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；多功能双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因‑3494至+235序列和完整3'‑UTR序列，人源TLR4基因‑3494至+235序列如SEQ ID NO:1所示，完整3'‑UTR序列如SEQ ID NO:2所示；人源TLR4基因‑3494至+235序列和3'‑UTR完整序列分别克隆于pGL3‑Basic质粒中萤火虫荧光素酶luc基因的上游和下游。本发明将TLR4基因上下游非编码序列分别无缝克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的上下游，使得载体的结构组成比传统荧光素酶报告质粒更加接近体内真实情况，有效避免外源启动子对实验结果的负面影响。

技术领域

本发明公开了一种基于人源TLR4基因的多功能双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

Toll样受体(Toll-Like receptor，TLRs)是模式识别受体(pattern recognitionreceptor,PRRs)，是炎症信号传递的门户蛋白，在生理状态下与其对应的配体结合后会引发细胞信号转导，引起下游多种与炎症反应相关基因的高表达，促进多种炎性细胞因子的释放，从而在对抗入侵病原体的过程中起到了至关重要的作用，能够有效激活天然免疫和获得性免疫应答。其中，TLR4是第一个被发现的Toll样受体蛋白，属于I型跨膜蛋白，它由胞外的氨基端、跨膜区以及胞内的羧基端三部分组成，大量表达在抗原提呈细胞的表面。大量研究发现，TLR4参与生物体内的多种炎症调节、免疫应答以及肿瘤发生的进程，与许多疾病的发生发展过程密切相关。TLR4受体激活引发的下游炎症级联反应往往会使疾病向不利的方向转化，虽然目前有大量研究工作着落在阻断或抑制TLR4信号通路各个节点基因表达上，但是目前仍然没有研发出特别有效的药物或治疗方法能够精准靶向TLR4信号通路而达到确切治疗疾病的目的。因此，深入研究TLR4基因表达调控机制实乃当务之急。

非翻译区(Untranslated Region,UTR)，是指位于mRNA链编码区两端不翻译为蛋白质的片段，位于编码区上游的mRNA片段被称为5'非翻译区(5'-untranslated region，5'-UTR)，位于编码区下游则被称为3'非翻译区(3'-untranslated region，3'-UTR)。大量研究表明非翻译区密切调控基因转录前和转录后的表达，5'非翻译区能够影响基因的mRNA的翻译效率、稳定性以及出核转运，从而导致蛋白表达水平的改变；3'非翻译区则主要影响mRNA的稳定性和翻译。其中，miRNA靶向结合至3'-UTR而负调控目的基因表达水平为近年来非编码区调控研究的一大热点。2017年，斯坦福大学Jin Billy Li课题组和中山大学张锐课题组共同报道了3'-UTR的编辑位点可能通过介导mRNA的降解来调控基因表达，这一研究对认识RNA编辑的进化和功能提供了新思路，特别是揭示了非编码区RNA编辑位点的功能重要性。此外，大量研究报道大量分布在非翻译区的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)位点能够影响基因的表达量，从而与肿瘤、免疫性疾病和心血管疾病等密切相关。