[发明专利]一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。本发明通过设计5'末端包含接口上下游序列同源臂的引物TPprimer1和TPprimer2，扩增得到TLR4基因的‑3494至+235序列，将其通过Gibson组装的方法无缝克隆至双荧光素酶报告载体pGL3‑basic的NcoI位点构建人源TLR4基因5'端启动子区双荧光素酶报告基因载体pGLTlr4/‑3494+235。本发明双荧光素酶报告基因载体可通过BglII、KpnI和EcoRI等限制性内切酶消化后重新连接而构建包含不同长度启动子的衍生型报告基因载体，进而用于在不同组织来源的细胞中分析TLR4基因的启动子序列，探讨TLR4基因启动子细胞特异性调控机制等。

技术领域

本发明公开了一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

Toll样受体(Toll-Like receptor，TLRs)是模式识别受体(pattern recognitionreceptor,PRRs)，是炎症信号传递的门户蛋白，在生理状态下与其对应的配体结合后会引发细胞信号转导，引起下游多种与炎症反应相关基因的高表达，促进多种炎性细胞因子的释放，从而在对抗入侵病原体的过程中起到了至关重要的作用，能够有效激活天然免疫和获得性免疫应答。其中，TLR4是第一个被发现的Toll样受体蛋白，属于I型跨膜蛋白，它由胞外的氨基端、跨膜区以及胞内的羧基端三部分组成，大量表达在抗原提呈细胞的表面。大量研究发现，TLR4参与生物体内的多种炎症调节、免疫应答以及肿瘤发生的进程，与许多疾病的发生发展过程密切相关。TLR4受体激活引发的下游炎症级联反应往往会使疾病向不利的方向转化，虽然目前有大量研究工作着落在阻断或抑制TLR4信号通路各个节点基因表达上，但是目前仍然没有研发出特别有效的药物或治疗方法能够精准靶向TLR4信号通路而达到确切治疗疾病的目的。因此，深入研究TLR4基因表达调控机制实乃当务之急。

荧光素酶报告基因系统是指通过定量荧光素酶催化荧光素氧化为氧化荧光素所发出的生物荧光来间接筛选影响目的基因表达的潜在调控因子并定量其调控活性的一种方法。传统的荧光素酶报告基因载体构建方法一般是将目的基因启动子序列中可能和调控因子靶向结合的其中一小段DNA序列，通过酶切连接的方法插入到商业化荧光素酶报告载体的多克隆位点中。但这种方法不适合大片段的插入，因为存在很多相同的限制性酶切位点相互干扰，往往找不到可用内切酶。此外，使用酶切连接的方法会在荧光素酶luc基因和目的插入片段之间残留一段限制性内切酶识别位点等多余序列，这段序列可能会影响实验结果的准确性。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，提供了一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用，通过扩增得到TLR4基因的-3494至+235序列，NcoI酶切pGL3-Basic质粒后回收酶切产物，将TLR4基因5'侧翼启动子区大片段无缝克隆至萤火虫荧光素酶luc基因的上游，构建可用于在不同组织来源的细胞中分析TLR4基因的启动子序列，研究TLR4基因启动子细胞特异性机制的荧光素酶报告基因载体，加快人类TLR4基因表达异常免疫性疾病的研究进程。

一种基于人TLR4基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因载体为pGLTlr4/-3494+235，载体的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

所述双荧光素酶报告基因载体包含人源TLR4基因-3494至+235序列，人源TLR4基因-3494至+235序列如SEQ ID NO:3所示，人源TLR4基因-3494至+235序列克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-Basic的NcoI位点。

所述双荧光素酶报告基因载体，通过BglII、KpnI和EcoRI等限制性内切酶消化后重新连接而构建包含不同长度启动子的衍生型报告基因载体，从而对比分析TLR4基因启动子序列，探讨TLR4基因启动子细胞特异性调控机制。