[发明专利]鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物SP4124及其PCR检测方法

说明书

本发明为一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物及其PCR检测方法，其设计特异性引物并建立用于检测毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性PCR检测方法，为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。本发明采用的技术方案为：所述特异性引物序列如下：SP4124‑F：5’‑ACTACACAAGTCCCGTCAAAC‑3’；SP4124‑R：5’‑CTATGCTGTCTTCCTCTATCCC‑3’。特异性引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的PCR检测方法为：首先富集纯化待测样本中的卵囊，提取卵囊总RNA并通过反转录得到cDNA，然后以上述cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增并对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现444bp的特异条带，提示待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。

一、技术领域：

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物SP4124及其特异、灵敏、快速PCR检测方法。

二、背景技术：

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于鸡肠上皮细胞内，造成肠道病变和损伤的寄生虫病，呈全球性分布，在鸡常见的7种球虫中，毒害艾美耳球虫是鸡小肠球虫病最主要的致病性球虫种类，主要危害8～18周龄的育成鸡，病鸡常出现下痢、血便等临床症状，严重感染后引起的死亡率可以超过25％，对育成鸡的养殖造成严重威胁。

目前，用于鸡球虫临床检测的方法主要包括形态学、免疫学以及分子生物学等方法。传统形态学观察操作简便，能够实现对样品的快速检测，但其检出率较低，不能准确鉴别鸡球虫种类，且需要检测人员具备一定的专业知识。免疫学与血清学方面，国内外学者建立了多种检测鸡球虫的血清抗体反应，包括色素试验法、间接血凝试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但由于鸡的特异性抗体效价一般很低，因而血清学诊断法在实际应用时效果有限，在生产实践中不如检查粪便中卵囊的方法简便可靠。分子生物学方法具有灵敏度高及特异性强的优点，可有效对鸡球虫种类进行鉴别，弥补了传统形态学和血清学检测的不足，已被广泛应用于鸡球虫的鉴别和诊断。鸡球虫的分子生物学检测法包括同工酶技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、常规PCR和多重PCR等。同工酶技术利用LDH和GPI酶的不同的种特异性迁移率进行虫种鉴别，但同一种内可能有亚带的变化。RAPD技术利用大量随机引物对全基因组中差异位点进行分析鉴别，技术简单，灵敏度高，能呈现全基因组范围内的差异，但由于该技术重复性较差，导致其在实际应用上存在一定的局限性。

另外已有研究者建立了基于鸡球虫18S rDNA序列、ITS-1序列的PCR法，可有效鉴别鸡球虫种类。但由于在球虫生活史中，从裂殖子到子孢子经历的一系列变化是由基因的差异表达实现的，基因组本身并未发生变化，所以这些基于基因组DNA建立的PCR方法不能对鸡球虫未孢子化和孢子化卵囊进行有效鉴别。

三、发明内容

本发明提供鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊特异性扩增引物SP4124及其PCR检测方法，其利用RNA-seq技术，筛选出毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的一个特异表达基因(GeneID:25471018)并设计特异性引物，建立用于检测毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性PCR检测方法，为鸡毒害艾美耳球虫的临床检测应用和推广提供理论依据和技术支撑。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊的特异性扩增引物，其特征在于：所述特异性引物序列如下：

SP4124-F：5’-ACTACACAAGTCCCGTCAAAC-3’；

SP4124-R：5’-CTATGCTGTCTTCCTCTATCCC-3’。

特异性扩增引物在检测鸡毒害艾美耳球虫孢子化卵囊中的PCR检测方法，其特征在于：所述的检测方法为：首先富集纯化待测样本中的卵囊，提取卵囊总RNA并通过反转录得到cDNA，然后以cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增并对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现444bp的特异条带，提示待测样本中存在毒害艾美耳球虫孢子化卵囊。