[发明专利]一种磷酸化抗体及其应用

说明书

本发明提供了一种磷酸化抗体，磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸磷酸化，还提供了应用，用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异，用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平和反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，具备较好的临床应用性和现实的治疗意义。

技术领域

本发明属于抗体技术领域，具体涉及提供一种磷酸化抗体及其应用。

背景技术

层粘连蛋白是一种细胞外基质糖蛋白，可为基底膜提供细胞粘附。层粘连蛋白受体(67LR)是编码295个氨基酸的mRNA翻译的37kDa前体蛋白质的更高分子量形式，作为层粘连蛋白受体，67LR控制着关键的细胞过程，包括细胞生长，细胞存活，细胞迁移，蛋白质合成及分化等，另外，其还有助于促进层黏连蛋白结合，核糖体生物新生，细胞骨架组织形成及核功能完善等。

局部血管严重痉挛、阻塞时，相应组织器官缺血后，即使血管再通，重新恢复血流，但缺血区并不能得到充分的血液灌注，即无复流现象。无复流现象可发生于心肌、脑、肾、骨骼肌等处。引起无复流的主要原因是微血管内皮细胞的肿胀、微血管外间质中由渗出液引起的组织间压增高和血小板聚集与/或白细胞嵌塞引起的微血管堵塞。因此，及时检测缺血发生时血管内皮细胞粘附连接的损伤程度，是防治无复流的关键因素。

67LR在增殖活化的内皮细胞高表达，在稳定的血管和内皮细胞低表达；67LR磷酸化可引起内皮细胞伪足形成，细胞迁移能力增加，RakshaKhusal等研究报道缺氧时67LR可磷酸化，但磷酸化位点未知，在缺氧环境下，内皮细胞67LR磷酸化会显著上调血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-cadherin)磷酸化水平，引起微血管内皮细胞的肿胀，微血管外间质渗出液增加。因此，检测缺氧时67LR具体位点的磷酸化水平，对评价血管内皮细胞粘附连接的损伤程度具有重要意义。然而，目前市场上尚未有相应的抗体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种磷酸化抗体及其应用，该磷酸化抗体是蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化，用于免疫印迹试验检测正常血管内皮细胞、缺氧血管内皮细胞及干预后再缺氧血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平的表达差异，用于检测血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化水平，反映血管内皮细胞粘附连接的破坏程度和血管内皮细胞钙粘蛋白的磷酸化水平和反映急性心肌梗死血管内皮屏障的损伤程度，具备较好的临床应用性和现实的治疗意义。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种磷酸化抗体，所述磷酸化抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸化抗体的蛋白质序列中第125位苏氨酸发生了磷酸化。

优选地，所述磷酸化抗体的制备方法为：

S1、将修饰肽的N末端与载体蛋白钥孔血蓝蛋白进行偶联反应，免疫动物后，采血收集，得到抗血清；所述修饰肽的蛋白质序列为C-RLLVVTDPRAD-N，所述修饰肽的C端的第6位苏氨酸发生了磷酸化；

所述修饰肽先后经过结构域分析，序列特异性分析，d线性表位预测，跨膜结构域预测，信号肽预测，亲水性分析，免疫原性及表位暴露性分析而得，所述修饰肽的结构域含有血管内皮细胞中67LR蛋白第125位苏氨酸磷酸化的目的位点，序列特异性高，能有效识别抗原的线性表位，且亲水性好，免疫原性及表位暴露性高；

S2、将S1中得到的抗血清进行纯化，得到磷酸化抗体。

优选地，S1中所述动物为实验级日本大耳白兔。