[发明专利]一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法

说明书

本发明公开了一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，所述方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针序列为：上游引物：5’‑CCACATGATCGCATGTGATTG‑3’；下游引物：5’‑CCGAAGGCTTGCTCCCAAA‑3’；荧光探针：5’‑CCTCCATCCCTCACGC‑3’；所述荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。本发明方法能够快速、准确地鉴定两歧双歧杆菌。

技术领域

本发明涉及一种饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法。

背景技术

双歧杆菌（Bifidobacterium）是重要的维持肠道菌群平衡的益生菌，因其具有促进维生素代谢、缓解乳糖不耐症、降低血清胆固醇、抗癌抗氧化、延缓衰老、缓解便秘等诸多益生作用而被广泛关注。人类根据该菌能在肠道定檀繁殖的特点，通过向饲料中添加双歧杆菌活菌制剂而使其在动物肠道内自然增殖的方法，人为地建立优势菌用于动物疾病治疗，且取得了很好的效果，国内有关于过活菌制剂治疗动物腹泻、白痢等病的相关报导。我国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》中也规定两歧双歧杆菌(Bifidobactirium bifidum)可以直接用于动物饲喂。

双歧杆菌制剂与之前长时间且大范围使用的抗生素相比，有许多优越之处，如安全可控、菌株同源、无污染、不会产生耐药菌株、无残留、提高生长性能，因此双歧杆菌制剂逐渐代替抗生素而得到饲料行业和养殖户的认可。并被广泛应用于动物饲料等多种益生菌产品中。研究表明，当双歧杆菌含量在10⁶ CFU/mL(g)以上时，才能在宿主肠道内发挥其生理功效。饲料中双歧杆菌活菌数量及菌株类别是判断其质量好坏和保健功能的重要指标。但由于双歧杆菌饲料的资金需求低、利润高、接受度广，因而吸引了众多的大小型饲料企业的参与，其中难免鱼龙混杂，饲料产品的品质难以保证。因此准确、快速的对双歧杆菌进行鉴定则尤为重要，但是目前国内没有饲料中双歧杆菌的检测和鉴定标准，亟需开发相关标准方法以补充空白与不足。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种方法，应用于饲料中两歧双歧杆菌的鉴定，为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于，所述的方法是应用特异性引物及荧光探针对两歧双歧杆菌的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针的序列为：

上游引物：5’-CCACATGATCGCATGTGATTG-3’；

下游引物：5’-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3’；

荧光探针：5’-CCTCCATCCCTCACGC-3’；

荧光探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，实时荧光PCR反应体系总体积为25 μL，其中2×TaqMan PCR Master Mix：12.5 μL，上游引物：0.5 μL，下游引物：0.5 μL，荧光探针：0.5 μL，浓度为10 ng/μL的DNA模板：1 μL，无菌去离子水：10 μL。

所述的饲料中两歧双歧杆菌的鉴定方法，所述实时荧光PCR反应的程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃、30 s，71 ℃、60 s，45个循环；在每个循环的71 ℃退火并延伸阶段收集荧光信号。