[发明专利]一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用，涉及gRNA基因工程技术领域，双重gRNA的基因表达元件包括如下结构：多克隆酶切位点I‑U6启动子‑gRNA特异性序列1‑结构序列‑中间连接序列‑U6启动子‑gRNA特异性序列2‑结构序列‑多克隆酶切位点III，设计的双重gRNA全套基因表达元件两端各有一处多克隆酶切位点，这些酶切位点方便之后与表达载体进行连接，且表达载体不受限制，因此可以将此双重gRNA全套基因表达元件直接连接到Cas9核酸酶表达载体中，以进一步提高转染效率与基因编辑的成功率，中间存在多克隆酶切位点，可利用这些酶切位点将双重gRNA系统“拆分成”两个单gRNA系统，由此构建各种动物模型。

技术领域

本发明涉及gRNA基因工程技术领域，特别是指一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用。

背景技术

基因编辑是当今研究的热点之一。而其中CRISPR/Cas9更是因其操作简单、方便，时间和成本都很低的优势，迅速风靡世界。CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶需要在crRNA和tracrRNA的协助下才能识别目的序列，然后对目的序列进行剪切以形成断裂的双链，从而进行基因编辑。之后经过改造，将crRNA和tracrRNA融合成一个RNA分子，即gRNA。

而CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以在一个gRNA的协助下进行单位点的基因编辑，也可以在多个gRNA的协助下进行多位点的基因编辑。目前单点编辑最为普遍，但单点基因编辑仅能在特定位点引入双链DNA断裂，如要移除基因组上一定长度的DNA片段，则无法实现，需依赖多位点基因编辑；另外，在科研和疾病治疗中，有时需要同时对两个或更多的基因进行编辑，单点基因编辑则无法实现，需依赖多位点基因编辑。目前多位点基因编辑中以双位点基因编辑应用最为广泛，即同时利用两个gRNA引导Cas9核酸酶对同一基因组的两个位点进行编辑。

申请人对于双位点基因编辑现有的方式研究发现，常用的双位点基因编辑由于载体的限制，存在转染成功率低，表达水平不一致的问题，上述问题会带来筛选时间和精力的增加。同时由于需要合成多个较长片段，极大地增加成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速、高效并且低成本地生成不受载体限制的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件及其构建方法与应用。

基于上述目的本发明提供的一种双重gRNA的基因表达元件，包括如下结构：多克隆酶切位点I-U6启动子-gRNA特异性序列1-结构序列-中间连接序列-U6启动子-gRNA特异性序列2-结构序列-多克隆酶切位点III。

可选的，所述结构序列包括骨架、框架及终止序列。

可选的，所述中间连接序列包括多克隆酶切位点II。

可选的，所述gRNA特异性序列1和gRNA特异性序列2均具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的碱基序列。

一种双重gRNA的基因表达元件的构建方法，包括如下步骤，

设计、合成引物并纯化，所述引物包括正向引物F1、F4、F5、F8和Fa，分别依次具有SEQ ID NO.3～7的碱基序列，反向引物F2、F3、F6、F7和Fb，分别依次具有SEQ ID NO.8～12的碱基序列；

以pGEM-T/U6-gRNA-X为模板，以引物F1、F3和F4、F2，第一次PCR扩增出构成U6-gRNA-1的DNA片段A和B，引物F5、F7和F8、F6，第一次PCR扩增出U6-gRNA-2的DNA片段C和D，并采用重叠PCR扩增将DNA片段A和B融合成U6-gRNA-1，C和D融合成U6-gRNA-2；并向U6-gRNA-1融合体系中加入引物F1、F2，U6-gRNA-2融合体系中加入引物F5、F6后，进行第2次PCR扩增，得U6-gRNA-1和U6-gRNA-2；