[发明专利]一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法

说明书

本发明公开了一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法，本发明利用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的一个检测日本血吸虫感染的引物组合建立了一种日本血吸虫感染的检测方和检测试剂盒。本发明能快速、准确地将被检钉螺中的日本血吸虫检测出来，同时适用于动物日本血吸虫感染的检测以及环境中日本血吸虫的监测。本检测方法检出率高、灵敏度高、特异性强、准确性高和设备简单，因此具有很好的应用前景和推广价值。

技术领域

本发明涉及寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种日本血吸虫中间宿主钉螺感染诊断的检测方法。

背景技术

血吸虫病是由血吸虫感染引起的严重影响人类健康以及社会经济发展的人兽共患寄生虫病，寄生于人体的血吸虫主要有日本血吸虫(Schistosomajaponicum)、曼氏血吸虫(S.mansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、间插血吸虫(S.intercalatum)、湄公血吸虫(S.mekongi)和马来血吸虫(S.malayensis)。根据世界卫生组织(WHO)统计，全球共有74个国家的流行地区约有2亿人仍受到血吸虫病的影响和威胁。据统计，截至2016年底，我国仍有约5.4万血吸虫病患者，局部地区的防治形势依然严峻。在我国，引起血吸虫病的主要病原体是日本血吸虫，是我国重要的公共卫生问题之一。

日本血吸虫的生活史包括虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫7个阶段。钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主。虫卵孵化出的毛蚴遇到钉螺后感染钉螺，经过母胞蚴、子胞蚴的无性繁殖阶段发育成尾蚴。尾蚴在水中经合适的温度和光照后从钉螺体内逸出，集中于水面，当人或一些哺乳动物接触尾蚴后，尾蚴利用吸盘粘附于皮肤表面并分泌组织蛋白酶，借助尾部摆动和身体伸缩力量钻入宿主皮肤感染宿主。在宿主体内，尾蚴经童虫阶段最终发育为成虫。

目前，检测日本血吸虫病的方法主要包括流行病学诊断、临床诊断和实验室诊断三大类。实验室诊断主要包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断方法主要包括粪便直接涂片法、定量透明厚涂片法、改良加藤厚涂片法、自然沉淀法、尼龙袋集卵法、毛蚴孵化法、直肠或乙状结肠黏膜活组织检查及病理检查。免疫学诊断方法主要有包括皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫酶染色法和单克隆抗体-酶等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查，但同时也暴露出不少问题。病原学诊断方法易漏检，且常需重复多次。免疫学诊断并非直接检测病原体，敏感性较低且特异性不足。以核酸扩增技术为基础的分子生物学技术迅速发展，为寄生虫病的诊断提供了快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。

2000年，Notomi报道了一种新的核酸扩增技术，即环介导等温核酸扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP)。这种新的核酸扩增技术特异性甚高且快速高效。该技术的关键是需要能识别靶序列上8个特定区域的6个特异引物，和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，即Bst DNA聚合酶。反应恒定温度为60～65度，时间仅需要0.5到1个小时。LAMP技术相比PCR具有以下优点：灵敏度高；特异性强；快速高效，在1h内即可完成，若在靶序列上进一步设计两条促环形成引物，扩增时间将在原来的基础上减少1/3～1/2；设备简单，在恒温金属浴锅或水浴锅中即可完成；产物检测方便，可肉眼直接观察焦磷酸镁沉淀或荧光显色剂SYBR GreenⅠ显色来判定结果。

目前，缺乏一种高效的检测钉螺中日本血吸虫感染的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的快速检测日本血吸虫中间宿主钉螺是否被感染的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：