[发明专利]一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

说明书

本发明公开了一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB，在三氯生表达质粒pFW01上过表达了phaCAB，可以在胞外合成苏氨酸，胞内合成PHB。本发明构建的菌株苏氨酸合成量大大提高，在摇瓶发酵水平产量为17.0g/L，在3‑L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为96.4g/L，在10L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为133.5g/L。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB生长状况良好，未引入外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。

技术背景

作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。

苏氨酸的工业生产方法主要有蛋白水解、化学合成和微生物发酵。相对于前两种方法，发酵法优点是原料便宜、反应条件温和、环境污染小、效率高等。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，基因操作简单，发酵周期短等优点，在工业生产饲料添加级苏氨酸中占主要地位。

由于目前苏氨酸生产高产菌是大肠杆菌，大肠杆菌虽生长迅速发酵周期短，但是转化率也并不高。该工业化生产的出发菌株，目前利用葡萄糖生产苏氨酸经济效益最好，但是转化率低，摇瓶作为对照时，转化率为40％。

发明内容

本发明目的在于提高该菌株的产量和转化率，并建立一种在大肠杆菌里高产苏氨酸的方法，同时这种方法可以运用到不同的产品生产。

本发明第一个目的是提供一株高产苏氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有苏氨酸生产能力的菌株为出发菌株，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为出发菌株，以质粒pFW01为表达质粒；所述TWF001和pFW01公开于2018年的论文《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shuntand the l-threonine biosynthesis pathway》。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF001中，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，该基因簇如GenBank登录号MH558939.1所示核苷酸序列。

在本发明的一种实施方法中，基因phaA、phaB和phaC分别编码的β-酮硫解酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶，在大肠杆菌中可以以乙酰辅酶A为底物合成β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将所述phaCAB基因簇与表达载体连接，在大肠杆菌宿主细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pFW01。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌TWF001。