[发明专利]一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途，其中双通道双光子荧光极性探针的结构如下：本发明双光子荧光极性探针分子在与其他干扰因素共存的体系中，对极性表现出专一性响应。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒副作用，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针对HeLa细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数为0.95)，适用于细胞线粒体内极性的双通道双光子荧光成像和定量检测。

技术领域

本发明涉及一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途，以实现双通道双光子荧光成像定量检测细胞线粒体内的极性，具有选择性专一、灵敏度高、生物毒性低的优点。

背景技术

线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器，例如产生三磷酸腺苷(ATP)为生理过程提供能量，因此它被称为细胞的能量源泉。此外，线粒体参与许多生理过程例如为大分子的生物合成提供能量和维持细胞内Ca²⁺水平的稳态等。线粒体与极性，粘度，pH等微环境参数密切相关。并且线粒体极性尤为重要，它能够影响线粒体活性。其中，线粒体功能障碍会导致一系列的疾病例如神经退行性疾病等。线粒体功能障碍会导致细胞凋亡。更为重要的是，线粒体功能障碍时线粒体极性会发生变化，因此通过检测极性改变能够进一步监测凋亡。

细胞凋亡，是程序性死亡的其中一个过程，在生物过程中扮演重要的角色，因此检测细胞凋亡对于生物学研究具有重要的意义。目前检测凋亡的方法是基于传统方法，例如检测半胱天冬酶蛋白的活性等。但这些方法的成本很高，周期很长和敏感性很差，并且它们成本很高不能满足评估细胞凋亡的要求。迄今为止，用于评估细胞凋亡的荧光探针分析方法仍然很少见，因此，需要尽快开发性能优异的荧光探针来检测细胞凋亡。

在过去十年中，荧光探针方法已经被广泛应用于监测生物过程，这主要基于荧光探针技术价格便宜，使用简单，灵敏度高，响应速度快。目前，已经开发非常多的荧光探针，但是检测线粒体极性的探针还是非常少的，因此开发性能优异的线粒体极性探针是非常迫切的。

极性在生物过程中是起着非常重要的作用。例如极性可以调节细胞器膜的渗透性。此外，极性的异常变化与某些疾病有很大的联系。当前检测极性的主要机制是基于ICT机理，这种机理对环境极性具有更高灵敏度，从而在检测极性过程中提供准确的结果，这对于生物环境的研究具有重要意义。并且，细胞凋亡过程中极性会有很大的改变，因此可以通过极性来检测凋亡，这对于研究细胞凋亡提供了一个很好的思路。

发明内容

本发明旨在提供一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以线粒体定位的比率型双光子荧光极性探针的结构，以实现双通道双光子荧光成像检测细胞凋亡过程线粒体中的极性变化，具有选择性专一、灵敏度高、双通道检测的优点，细胞毒性测试表明本发明荧光探针对细胞几乎没有毒性作用。

本发明双通道双光子荧光极性探针，简记为Mito-PF，以咔唑为母体，其结构式如下：

本发明双通道双光子荧光极性探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将化合物9-乙基-6-碘-9H-咔唑-3-甲醛(1.0g，2.86mmol)，4-氟苯乙炔(0.41g，3.44mmol)，三苯基磷二氯化钯(9.65mg，0.014mmol)，碘化亚铜(5.24mg，0.027mmol)和三乙胺(2ml)加入反应器中，在30℃无水无氧条件下搅拌12小时；将混合物冷却至室温，将沉淀过滤并浓缩，得到粗产物；通过柱色谱法(石油/二氯甲烷＝4：1作为洗脱液)纯化粗产物，得到中间体1，0.80g，产率为82％。