[发明专利]一种基于PCR技术快速区分稻梨孢和灰梨孢的方法及其所用特异性引物

说明书

本发明公开了一种基于PCR技术快速区分稻梨孢和灰梨孢的方法及其所用特异性引物。该特异性引物为P04900或P00835；所述P04900为对应于D04900的上游和下游的一对PCR引物，所述D04900为MGG_04900基因在稻梨孢和灰梨孢这两个物种之间的序列差异性片段；所述P00835为对应于D00835的上游和下游的一对PCR引物，所述D00835为MGG_00835基因在稻梨孢和灰梨孢这两个物种之间的序列差异性片段。利用该特异性引物可通过PCR扩增出的条带大小就可以区分稻梨孢和灰梨孢这两个近似种，较以往的方法相比，该方法省时、省力，简便，且结果准确、可靠。

技术领域

本发明涉及植物保护和生物技术领域中一种基于PCR技术快速区分稻梨孢和灰梨孢的方法及其所用特异性引物。

背景技术

梨孢属(Pyricularia)真菌(简称梨孢菌)是一类重要的植物病原菌，除侵染水稻引起稻瘟病外，还能侵染谷子、小麦、大麦等粮食作物以及牛筋草、狗尾草、稗草、马唐等多种禾本科杂草。稻梨孢(无性型为Pyricularia oryzae，有性型为Magnaporthe oryzae)和灰梨孢(无性型为Pyricularia grisea，有性型为Magnaporthe grisea)是梨孢属中研究最多的2个种。稻梨孢和灰梨孢在形态学上无明显差异，成熟分生孢子均为梨形，具两个隔膜，也无法用孢子大小进行区分。这两个种的寄主范围不同，寄主专化性有明显差异。稻梨孢能引起水稻稻瘟病病害，而稻田周围杂草受稻梨孢或者灰梨孢的侵染引发草瘟病。稻梨孢或灰梨孢侵染禾本科植物，以叶部和节部发生为多，典型症状为形成梭形病斑，外有黄色晕圈，背面产生褐色霉层，显微镜检可观察到分生孢子梗及梨形分生孢子。杂草来源梨孢菌与水稻来源梨孢菌之间可能存在交互侵染(Ou,1972.Rice Breeding:227-237)。可以肯定的是，杂草来源梨孢菌中的部分稻梨孢可以侵染水稻，田间杂草来源稻梨孢有可能在稻瘟病病害循环中发挥作用，田间感病杂草有可能成为越冬寄主，并有可能在稻瘟病暴发过程中起到推动作用。因此，使用特异性引物对稻梨孢和灰梨孢进行快速区分鉴定，能够大大节省测序时间，有利于稻瘟病病害的田间监测与防控。

至2019年5月，在Pyricularia数据库中已公布有208株稻梨孢及6株灰梨孢共214株菌的全基因组序列。之前有研究基于3个基因的序列分析将寄主为马唐的梨孢菌划分为灰梨孢(Couch and Kohn,2002.Mycologia,94:683-693)，但是Chio等人在2013年对103株来自于11种不同寄主的菌株进行聚类分析时发现，有2株马唐来源的梨孢菌与Magnaportheoryzae聚为一支，2株牛筋草及1株水稻来源的梨孢菌与Magnaporthe grisea聚为一支(Chio et al.2013.PLoS ONE,8:e57196)。因此，单纯以寄主范围来划分菌株的种类是不准确的。采用常规的形态学鉴定方法和寄主范围均不能将二者区分开。分子鉴定方法主要采用全基因组测序分析、DNA指纹图谱和比较序列分析等方法。全基因组测序分析、DNA指纹图谱主要用于对微生物的深入研究，过程复杂，投入资金大。比较序列分析的方法在物种鉴定中较为常用。如Couch和Kohn(Couch and Kohn.2002.Mycologia,94:683-693)基于actin、beta-tubulin和calmodulin三个基因的序列分析对Magnaporthe oryzae和Magnaporthegrisea进行区分；Klaubauf等人利用LSU、ITS、RPB1、actin和calmodulin的部分DNA序列对梨孢属真菌进行了系统发育分析，结果表明稻梨孢和灰梨孢被分为两支(Klaubauf etal.2014.Studies in Mycology,79:85–120)。以往准确区分稻梨孢和灰梨孢，一般是采用多基因的序列分析，其过程是：1)提取菌株DNA，2)用多个基因的引物进行PCR扩增；3)对目的条带进行回收、测序；4)对得到的序列在GenBank数据库中进行相似度比较。此方法较为复杂且耗费时间，成本也比较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何基于一种特异基因或使用一对特异性引物快速区分稻梨孢和灰梨孢。