[发明专利]利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法

说明书

一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法，属于病毒疫苗领域。本发明利用基因工程方法单独表达含有跨膜区的病毒包膜蛋白，再将其与制备的脂质体混合，通过逐步去除表面活性剂的方法使含有跨膜区的病毒包膜蛋白定向镶嵌在脂质体上。本发明的制备方法是以完整的病毒包膜蛋白制备疫苗，利用完整包膜蛋白蛋白的跨膜区使包膜蛋白定向排列在脂质体表面，利用脂质体模拟天然病毒包膜结构，提高疫苗免疫活性。

技术领域

本发明涉及病毒疫苗领域，特别涉及一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

疫苗是预防和控制传染病最经济、最有效的手段，从最早的接种用牛痘，到现在多种多样的疫苗，为保护人类健康起到重要作用。

当前使用的疫苗主要有三种类型：减毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗。减毒活疫苗是利用低毒性为代价诱导机体形成抗体，免疫效果不理想并有安全隐患。灭活疫苗只是在使用阶段使病毒灭活，要生产过程中仍是使用有感染性的病毒，生产环节存在风险。基因工程疫苗通过异源表达病毒的包膜蛋白诱导人体形成抗体，过程中不使用活性病毒，过程安全；但基因工程疫苗多是病毒包膜蛋白的胞外域部分，没有完整的病毒包膜蛋白，缺少了跨膜区与胞内域，不能保持天然病毒包膜蛋白的排布形式，免疫效果不如完整的病毒包膜蛋白。

发明内容

本发明为解决现有技术中存在不足，利用脂质体镶嵌病毒的包膜蛋白，使疫苗具有与天然病毒包膜的相似的包膜结构，提高疫苗的免疫活性。

本发明的发明构思是：根据天然病毒包膜蛋白是通过跨膜区镶嵌在一个来源于寄主细胞的膜性上的结构特点，利用脂质体模拟寄主细胞膜，通过病毒包膜蛋白跨膜区使病毒包膜蛋白定向排列在脂质体表面上，形成与天然病毒包膜一致的包膜蛋白结构，提高疫苗的免疫活性。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：一种利用跨膜区定向排列病毒包膜蛋白疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1利用基因工程方法单独表达含有跨膜区的病毒包膜蛋白；病毒的包膜蛋白都有一段跨膜区并通过跨膜区部分镶嵌在包膜上，跨膜区保证病毒的抗原决定簇正确排列在包膜上，对于病毒的侵染、对于抗原活性都非常重要。利用病毒的包膜蛋白制备疫苗，克隆目的基因时必须包括病毒包膜蛋白的跨膜区部分。

S2以卵磷脂与胆固醇制备脂质体，或与人工合成类脂共同制备脂质体；

S3将含有跨膜区的病毒包膜蛋白与脂质体混合，通过逐步去除表面活性剂的方法使含有跨膜区的病毒包膜蛋白定向镶嵌在脂质体上。具体的方法是：利用含有表面活性剂的溶剂(如：LDAO(月桂基二甲基氧化胺)、Brij-35(L23聚氧乙烯月桂醚)、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、CHAPS、DDM(4.4'-二氨基二苯基甲烷)、SC等)进行含有跨膜区的病毒包膜蛋白的分离与纯化，利用表面活性剂保证病毒包膜蛋白在溶液中的溶解性；把制备好的脂质体同样用表面活性剂溶解，可以保证与病毒包膜蛋白溶液混合过程中不会造成病毒包膜蛋白的沉淀或析出；表面活性剂能够保证病毒包膜蛋白与脂质体(类脂)充分混合，向混合溶液中加入可以吸附表面活性剂的疏水性树脂(也称beads，美国伯乐公司产品，型号：Bio-Beads SM-2)，疏水性树脂吸附表面活性剂同时使类脂与病毒包膜蛋白组装形成脂质体，通过离心去除疏水性树脂及其吸附的表面活性剂，最终获得镶嵌有病毒包膜蛋白的脂质体。也可以不加入疏水性树脂直接使用透析的方法缓慢去除表面活性剂，能够达到相同的效果。

优选地，所述的病毒包膜蛋白为基因工程合成的完整病毒包膜蛋白或使用灭活病毒的包膜蛋白。

优选地，脂质体使用天然磷脂组装，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺。进一步地，天然磷脂为二油酰磷脂酰胆碱。

优选地，脂质体可以使用胆固醇与人工合成类脂，或胶束、或其他可镶嵌病毒完整包膜蛋白的微粒。