[发明专利]分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性

说明书

本发明涉及鱼类基因工程技术领域，公开了一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性，鲤抗病毒蛋白Rhbdd3编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第1‑1050bp所示的序列，其编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2中所示的序列。本发明克隆的Rhbdd3蛋白的表达不仅可以抑制鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖，而且还可以抑制传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的增殖。Rhbdd3蛋白在细胞抵御SVCV及IPNV的感染过程中发挥着重要作用，同时不影响细胞的正常活性。本发明的基因和蛋白为制备抗SVCV和IPNV药物提供了新的靶点，也为鱼类抗病毒新品种的培育提供了重要的技术依据。

技术领域

本发明涉及淡水鱼类基因工程技术领域，尤其涉及一种分离的鲤抗病毒蛋白Rhbdd3及其抗病毒活性。

背景技术

伴随着我国水产养殖业的不断发展，水生动物疾病尤其是病毒性疾病的发病率近年来呈现明显的上升趋势。水生动物病毒病发病快、死亡率高、大多没有有效的疫苗或针对性的药物，一旦发病很难治愈，带来巨大的经济损失，严重制约着我国水产养殖业的健康和可持续发展。因此，开发广谱抗病毒药物和培育鱼类抗病毒新品种具有十分重要的实用价值。

天然免疫是机体抵抗病毒侵袭的第一道防线，最新研究发现，Rhomboid家族成员Rhbdd3(Rhomboid domain-containing protein 3)在哺乳动物天然免疫中发挥了重要作用。Rhomboid家族最先于果蝇中发现，其具有跨膜结构和蛋白酶活性。基于序列的相似性，目前共有14种蛋白归于Rhomboid家族，其中5种具有蛋白酶活性，9种则失去了蛋白酶活性。小鼠中研究发现，Rhbdd3主要分布于细胞内体且不具有蛋白酶活性，poly(I:C)处理会诱导小鼠NK细胞Rhbdd3的上调，Rhbdd3进而又可以调节NK细胞和树突状细胞的活性。然而，目前公共数据库中尚无鱼类Rhbdd3基因的确定序列，鱼类Rhbdd3蛋白的功能也尚未见任何报道。本发明首次通过PCR扩增获得了鲤Rhbdd3基因片段的核苷酸序列，并在此基础上构建了Rhbdd3真核表达质粒，转染鲤鱼上皮瘤细胞EPC和鲑鱼囊胚细胞CHSE-214后，探明了Rhbdd3蛋白过表达对危害重大的鱼类病毒—鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)增殖的影响。

鲤春病毒血症(SVC)是一种由鲤春病毒血症病毒(SVCV)导致的急性暴发性出血症。该病常于春季在水温8～20℃，尤其是13～15℃时暴发流行。鲤、锦鲤、草鱼、鲫及其变种、鲢、鳙等多种鲤科鱼类均能被感染。病鱼常聚集于出水口处，体色发黑、眼球突出、肛门红肿、腹部膨大及严重腹水、呼吸缓慢、往往失去平衡而侧游。该病发病急、病鱼死亡率可高达90％左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击。因其高致病性，SVC被世界动物卫生组织OIE列为必须申报的疫病，也是我国鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。2008年，农业部第1125号公告也将该其列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是迄今唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病。目前，尚缺乏有效控制SVC的药物和方法，国际上通行的控制措施是进行SVCV的监测，及早发现并进行隔离和扑杀。

传染性胰腺坏死病毒(IPNV)为鲑科鱼类高度传染性疾病—传染性胰腺坏死病(IPN)的病原。IPN病往往呈急性流行，感染幼鱼死亡率超过90％。病鱼体色发黑、眼球突出、腹部膨大、皮肤和鳍条出血，组织切片可见胰腺组织坏死。该病常在水温10～15℃时流行，发病后幸存鱼成为IPNV携带者，并可以通过尿液、粪便、鱼卵、精液等将病毒释放到环境中继续传播。IPN最早在美国北部发现，随后在欧洲、日本等多国发生流行，并已于20世纪80年代传入我国，其暴发主要集中在我国东北地区虹鳟以及大西洋鲑的养殖场，且近些年来有逐步蔓延之势，对我国水产养殖业构成了巨大威胁。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有广谱抗病毒活性且不影响细胞正常活性的抗病毒蛋白，为危害性较大的鱼类传染性病原SVCV和IPNV的预防和治疗提供新的药物靶点，也为鱼类抗病毒新品种的培育提供重要的技术依据。

发明内容