[发明专利]基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：该多重荧光PCR方法包括以下步骤：

1)根据不同待检样品中的DNA组成情况，确定需要鉴别的不同目的DNA序列；

2)设计并合成用于扩增对应目的DNA序列中任意一部分具有特异性的序列片段的引物；

3)利用单重PCR扩增验证步骤2)中所设计的引物的有效性以及特异性；

4)分别分析目的DNA序列及其任意数量的组合方式，以对应目的DNA序列或包含目的DNA序列的基因组DNA为模板，分别利用经过步骤3)验证的针对不同目的DNA序列的引物进行多重PCR扩增，并在扩增完成后对扩增产物进行高分辨熔解，采用归一化、差异化或者主成分分析对获得的高分辨熔解曲线进行特征提取，然后将提取得到的特征信息合并，得到标准鉴别图谱；

5)提取某待检样品中的DNA作为模板，按照步骤4)进行多重PCR扩增以及对扩增产物进行高分辨熔解并获得高分辨熔解曲线，对该高分辨熔解曲线采用与获得所述标准鉴别图谱同样的特征提取方法进行分析，将分析结果与所述标准鉴别图谱比对，根据在所述标准鉴别图谱中经比对所匹配的特征信息确定所述某待检样品中的DNA组成情况。

2.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，PCR扩增的片段位于对应动物种类的基因组DNA中。

3.根据权利要求1或2所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的引物选自扩增山羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P1、扩增绵羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P2、扩增牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P3、扩增水牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P4中的两对以上引物。

4.根据权利要求3所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述引物对P1的序列为：

上游引物：5'-CACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'

下游引物：5'-AGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'

引物对P2的序列为：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'

引物对P3的序列为：

上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'

下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'

引物对P4的序列为：

上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'

下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。

5.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤4)、步骤5)中，高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始以0.05℃/s速率逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。

6.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述待检样品采集自乳制品、生乳或其他生物样品。

7.一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于构建多重PCR扩增的反应体系的试剂以及用于比对的针对多种目的DNA的靶序列扩增产物的标准高分辨熔解曲线形状特征图谱，所述标准高分辨熔解曲线形状特征图谱是通过对所述靶序列中的一种以及任意数量组合的扩增产物的高分辨熔解曲线进行归一化、差异化或者主成分分析而得到的；所述试剂包括用于扩增对应靶序列的PCR引物以及用于PCR实时荧光扩增的饱和荧光染料。