[发明专利]一种重组酯酶及其应用

权利要求书

1.一种重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因为SEQ ID NO.1中4174bp-4896bp所示。

3.一种权利要求1所述重组酯酶编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述工程菌，其特征在于所述工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建而成。

6.一种权利要求1所述重组酯酶在催化邻苯二甲酸酯制备邻苯二甲酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组酯酶编码基因的工程菌诱导培养获得的湿菌体经超声破碎提取的纯酶为催化剂，以邻苯二甲酸酯为底物，以pH7.0-10.0的PBS缓冲液为反应介质，在30-50℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得邻苯二甲酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二甲酯。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述底物加入量以反应介质体积计为10-400mg/L，所述催化剂加入量以反应介质体积计为0.15～0.6U/mL。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含重组酯酶编码基因的工程菌接种于含50ng/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，180r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.6，于22℃，180r/min摇床放置30min后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，22℃培养16-18h后，将菌体重悬到4℃预冷的pH8.0结合缓冲液中，超声破碎；超声破碎的条件为：功率175W，工作3s，间歇3s，总工作时间为3min；将破碎后的细胞裂解液在4℃下12000rpm离心15min，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后上镍柱，待上清液流尽，加入3倍体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集流出的洗脱液，获得纯化的重组酯酶；所述结合缓冲液组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 8.0；所述洗脱缓冲液组成：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。