[发明专利]用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。所述分子探针优选具有如下结构：5′‑Cy5‑CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG‑BHQ2‑3′。本发明提供的分子探针可用于CLDN18.2 RNA水平的定量研究，也可用于CLDN18.2 RNA在细胞水平定性或半定量的分析。本发明为循环肿瘤细胞检测提供有力手段。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是癌症标志物CLDN18.2检测领域，具体地说，涉及一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。

背景技术

RNA对于细胞而言十分重要，经典理论认为RNA是DNA到蛋白的中介。近几十年的研究表明RNA在体内发挥着多种重要功能，比如传递及翻译遗传信息，分子机器的结构支撑，沉默基因表达，催化某些反应。如果能在亚细胞层面实时对RNA进行空间定位，有利于更深入地了解细胞行为，更重要的是，可以从分子水平了解细胞对于外界刺激的反应，研究药物作用机制或者疾病诊断。

分析信标于1996年开始应用于PCR检测；一般为寡聚核苷酸结构，能够和靶向区域互补结合，呈环状，两端各有3-6个核苷酸互补结合，使得两端原有的发光和淬灭基团分子间距离大幅度减少，从而没有任何光发出，当分子信标主题部分与靶向区域结构后，由于两个距离开始增长，发出的光不能被淬灭，可以被荧光接收器识别。分子信标连接靶向核苷酸之后，荧光信号强度可上升10倍。

CLDN18.2蛋白是一种跨膜蛋白，属于Claudins(CLDNs)家族成员之一，是细胞紧密连接的重要结构成分，它在上皮细胞层起渗透调控，屏障，伤害抵抗和极化作用。人类CLDN18基因的第一个外显子存在两个等位基因，可表达CLDN18.1和CLDN18.2两种不同的剪切突变体，导致包括细胞外环1在内的69个氨基酸序列的差异，故两者细胞外抗原表位存在差异。研究发现CLDN18.2蛋白在正常健康组织中表达高度受限，仅在胃粘膜中存在。CLDN18.2蛋白在多种恶性肿瘤发生发展过程中频繁发生异常改变，如胃癌发生后，CLDN18.2表达量大幅度上升。胃癌中CLDN-18的表达是下降的，但CLDN-18.2的表达反而随肿瘤进程大幅度上升，稳定地表达于特定肿瘤组织，参与肿瘤细胞的增殖分化和迁移，这种现象在食管癌、胃癌、胰腺癌、甚至胆管癌中均有体现，由此可见claudin-18.2可作为消化道多种肿瘤的检测和治疗靶点。近年来，其特异性抗体claudiximab(zolbetuximab/IMAB362)在最新的临床试验中取得了显著成功。因此，通过CLDN18.2阳性肿瘤的检测来指导其临床靶向用药就格外重要。由于CLDN 18.1和CLDN 18.2，两者高度同源(氨基酸92％重合)，给抗体的研发和临床检测造成了很大的困难，同时如果以RNA作为检测手段能够更好地跟踪CLDN18.2在细胞内的生理反应，了解肿瘤细胞的作用机制。通过将靶向治疗与CTC基因分型的液体活检相结合的个体化治疗方案，将为CLDN18.2恶性肿瘤的诊断和治疗带来新的希望，使恶性肿瘤患者具有更高的生存率。综上，CLDN18.2 RNA水平检测是一个很好的选择。采用分子信标技术可对大量样本进行检测，但对有限数目细胞的检测目前仍存在一定难度，难以保证检测的高覆盖度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。

本发明构思如下：设计一段具有颈环状结构的寡聚核苷酸，化学本质可以为DNA也可以为RNA或DNA/RNA，在5’末端和3’末端分别有一个荧光发射基团和与之对应的荧光淬灭基团，且5’末端和3’末端各有3-6个核苷酸相互匹配从而以氢键相互吸引，常规环境下成“颈环”结构，此时照射荧光激发光时，由于荧光基团和与之对应的淬灭基团物理距离很近从而引起荧光集团发出的光被淬灭基团所吸收而无法被检测，序列与靶向CLDN18.2特有序列相结合，一旦结合后会引起荧光基团和与之对应的淬灭基团物理距离增大从而引起荧光淬灭机制解除进而被检测到。