[发明专利]MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用在审

申请号：	201910566746.1	申请日：	2019-06-27
公开（公告）号：	CN110106241A	公开（公告）日：	2019-08-09
发明（设计）人：	蒋涛华;邵悦;傅坚刚	申请（专利权）人：	南京科佰生物科技有限公司
主分类号：	C12Q1/6858	分类号：	C12Q1/6858;C12Q1/6886
代理公司：	北京酷爱智慧知识产权代理有限公司 11514	代理人：	袁克来
地址：	210000 江苏省南京市栖霞区***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	标准品稳定检测微卫星制备方法和应用检测毛细管电泳标准分析多次重复多个单位分析数据临床检测设计原则数据完整样品提取方法学可重复配对制备分发兼容细胞再生评估重复分析
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【权利要求书】：

1.一种MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S101：首先选取10～20对配对细胞，其中，二分之一为肿瘤细胞，其余为正常细胞；然后检测位点BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27来评估MSI状况，同时引入Penta C、PentaD、Amel位点；

S102：收集细胞；

S103：采用promega的DNA提取试剂盒，按照说明书提取DNA；

S104：对提取的DNA做QC检测，Qubit3.0检测浓度，Nanodrop检测OD260/280纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，

S105：合成引物；

S106：配置PCR反应体系20ul，设计PCR程序：37℃，2分钟；94℃，10分钟；94℃，30秒，60℃，1分钟，70℃，1分钟且进行35个循环；60℃，45分钟；4℃，∞；

S107：PCR产物毛细管电泳，以seqstudio基因分析仪进行毛细管电泳检测，根据基因分析仪操作说明进行选择“Fragment Analysis”检测，导出数据用GeneMapper软件分析；

S108：检测峰高没有出现超阈值现象，否则应稀释PCR产物进行毛细管电泳检测；

S109：以正常组织峰图作对照，比较肿瘤组织6个单核苷酸标志物BAT-26、NR-21、BAT-25、MONO-27、NR-27和NR-24和3个双核苷酸重复位点D2S123、D17S250、D5S346片段大小改变情况，产物片段变化超过2.5nt即判定该基因不稳定，反之稳定；再根据同一组织肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定该样本微卫星状态；

S110：按照步骤S101-S109重复3次，判断12个位点是否数据统一和稳定，其中，数据稳定、准确的选为标准品。

2.根据权利要求1所述的MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，其特征在于，在所述步骤S102中，具体包括如下步骤：

S1021：从液氮罐中取出20株细胞，放置在水浴锅中融化并摇晃；

S1022：等细胞融化后，取出水浴锅，用酒精擦拭；

S1023：在生物安全柜中吸取细胞悬液到无菌的15mL离心管中，再补加9mL完全培养基；

S1024：在1000rpm转速下离心5min，然后轻轻缓慢倒出上清；

S1025：加入6mL完全培养基，用移液管轻微吹打沉淀，重悬；

S1026：重悬后的细胞悬液转移到T-25flask，晃匀后，转移至CO₂培养箱；

S1027：待细胞生长到80％汇合度或者密度达4x10^e5/mL时，收集所有的细胞至15ml离心管，其中贴壁细胞需要用胰酶消化，悬浮细胞直接收集；

S1028：在1000rpm转速下离心5min，然后轻轻缓慢倒出上清，加入10ml的1xPBS，重悬；

S1029：在1000rpm转速下离心5min，然后轻轻缓慢倒出上清。

3.权利要求1或2的方法制备的MSI微卫星不稳定检测的标准品。