[发明专利]一株利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC及其应用

说明书

本发明涉及一株利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明细胞株NLC，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号CGMCC No.17391。将利福平完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后一次用利福平完全抗原冲刺免疫（腹腔注射）。将高效价，低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合；再经过间接竞争酶联免疫法筛选并三次亚克隆，最终得到杂交瘤细胞株NLC。此细胞株分泌的单克隆抗体，对利福平具有较好的特异性和检测灵敏度，可实现对水产品中利福平残留量的检测，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

利福平（Rifampicin，RFP）又名甲哌利福霉素，是一种半合成利福霉素类抗生素，为广谱抗生素，对结核杆菌有高度抗菌活性，临床主要用于抗结核治疗，也是一种水产专用的渔药。利福平适用于海水养殖鱼、虾、蟹类等因弧菌、球菌引起的出血、腹水、溃烂、肠炎、白便；对海参因细菌感染导致的化皮，肿嘴；在鱼、虾、蟹、贝类育苗期间，对发光菌、弧菌等具有强力抑杀作用。利福平虽未批准用于水产动物，但在实际水产养殖中使用广泛，在人体内蓄积对健康产生危害，其耐药性也有转移扩散到人体的风险，对消费者的健康存在很大的隐患。有报道指出利福平可致人肝功能、肾功能损害以及各种皮疹等疾病。

目前国内外对水产品中使用的利福平没有特定的限量标准。我国在《2018年兽药残留标准制修订项目的通知》中提出了制定《水产品中利福平残留量的测定LC-MS-MS》标准。因此，为保障水产品质量安全和消费者身体健康，促进水产养殖业的健康、可持续发展，有必要对水产品中的利福平残留进行检测和控制。目前对利福平的检测主要是仪器检测，尤其以高效液相色谱法为主。然而这些仪器分析方法的前处理复杂，需要消耗大量人力物力，不适用于大量样品的快速检测；因此为了维护消费者的利益，建立一种针对利福平的高效、快速的检测方法势在必行。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为简便、快速的检测方法，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对利福平的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供一株利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC，由该细胞株制备的抗体对利福平具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立利福平的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCCNo.17391。

利福平单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.17391的利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC分泌产生。

所述利福平单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中利福平残留的分析检测。

本发明提供的利福平单克隆抗体杂交瘤细胞株NLC的制备基本步骤为：

（1）完全抗原RFP-CDI-KLH的制备：称取11.0mgRFP（利福平与血蓝蛋白（KLH）摩尔比为6000：1）和30.3mg N,N'-羰基二咪唑（CDI），溶解于600 μL无水1,4-二氧六环中，48-52℃左右活化6-8h，加入100μL水终止反应，称为A液；取10 mg KLH，加入等体积pH=8.6、0.01M碳酸盐缓冲溶液CB，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应24h；即得偶联物RFP-CDI-KLH混合液；然后用0.01M PBS（pH=7.2）溶液透析三天，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原RFP-CDI-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；