[发明专利]一种基于外周血血浆游离DNA核小体足迹差异的聚类分析方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于外周血血浆游离DNA核小体足迹差异的聚类分析方法及应用，所述具体方法包括:(1)外周血血浆游离DNA高通量测序数据的获取；(2)标准核小体定位区域数据库的构建；(3)各样品测序数据与标准核小体定位区域数据库进行对比分析；(4)筛选核小体足迹差异的覆盖度数据并进行标准化；(5)采用等级聚类法根据样本间的相关性对标准化后的数据进行聚类分析；本发明提供的方法可有效避免现有方法对组织或细胞的依赖，全面提升了高通量测序数据分析的深度和准确度，实现了对肿瘤患者的无创放化疗敏感性预测，具有全面、准确、覆盖度高的特点；属于生物技术领域。

技术领域

本发明公开了一种基于外周血浆游离DNA核小体足迹差异的聚类分析方法，具体地说，是基于外周血血浆游离DNA全基因组测数据的核小体足迹差异聚类分析方法，属于生物技术领域。

背景技术

核小体作为真核生物染色质的基本单位，是一种典型的DNA与组蛋白结合的生物大分子，是表观遗传学的重要内容。在不同细胞状态下，核小体定位是动态变化的，其位置的改变会影响转录因子与DNA的结合，从而调控基因特异性表达。因此，分析核小体足迹差异，发现不同条件下核小体足迹变化具有重要意义。肿瘤中由于处于低氧、高酸度的极端环境，同时肿瘤细胞间存在激烈的竞争，大量的肿瘤细胞发生凋亡。当细胞发生凋亡后，细胞核中的DNA会被DNA酶逐渐降解并被释放到外周血中。而当DNA和蛋白结合形成核小体，DNA就会受到蛋白的保护而不被酶降解，相反裸露的DNA则会被酶降解。由于细胞中基因的表达水平和核小体的结合程度密切相关，高表达基因的核小体结合数目较少则相对容易被降解，低表达基因的核小体结合数目较多则相对难以被降解。通过对外周血血浆游离DNA进行高通量测序，并对测序数据深度分析，可在全基因组范围内发现核小体足迹差异信息。

目前治疗肿瘤常用的方法是外科手术，化疗和放疗。手术只能切除可见的肿瘤病灶，而不能切除发生肿瘤的病因，因此手术后病人容易复发；化学药物治疗在恶性肿瘤综合治疗中仍然是主要手段，但目前化疗的疗效仍不理想。原因是肿瘤本身存在着异质性，即便同一组织学类型，分化程度相同的肿瘤对同一药物的敏感性不同。例如胃癌患者的单药有效率仅为15％-30％，丝裂霉素(MMC)有效率为30％，氟尿嘧啶(5-FU)有效率为21％，表阿霉素(EDI)有效率为19％，联合化疗的有效率也仅为30％-50％。由于化疗药物一般都具有较强的毒性，不适当的化疗既给患者造成痛苦，又不能缓解病情，更重要的是有可能诱发多重耐药，导致治疗失败。放疗是利用高能放射线灭杀癌细胞的治疗方法，治疗范围比较局限，局部控制效果较好，但放疗在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常细胞均有毒害作用，并不是每个病人都适合放疗。因此如何更有效地筛选适合的治疗手段和药物，指导临床治疗以提高疗效已成为肿瘤临床治疗瞩目的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的建立一种外周血血浆游离DNA核小体足迹差异的聚类分析方法，并筛选出肿瘤放化疗敏感患者与不敏感患者在核小体足迹定位差异的基因，使用秩和检验方法对同一个基因在肿瘤放化疗敏感患者和不敏感患者中的核小体足迹差异基因进行聚类分析，从而实现无创肿瘤放化疗敏感性预测。

本发明提供的技术方案是这样的：

一种基于外周血血浆游离DNA核小体足迹差异的聚类分析方法及应用，所述方法包括如下步骤：

(1)将外周血血浆游离DNA进行高通量测序，获取各样品的高通量测序数据；

(2)根据UCSC的RefSeq数据库中所有人类蛋白编码基因的注释信息，获取每个基因的转录起始位点(TSSs)和转录终止位点(TTSs)上下游1Kb区域的基因组位置，构建标准核小体定位区域数据库；