[发明专利]用于检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开用于检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法。本发明通过设计牛支原体的LppA基因的特异性引物、探针完成了牛支原体的精确检测，该引物探针组合能够做到牛支原体标准株及野生株种内的保守性以及牛支原体与其他致病菌种间的特异性。本发明对检测过程中最佳反应时间与最佳反应温度、检测的特异性、敏感性、重复性和稳定性均进行了探索，找到了最佳反应条件，建立了特异性好、敏感性高且可以稳定重复的牛支原体快速检测方法，具有操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备，非常适合没有任何实验基础的人员操作。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种牛支原体快速检测的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)隶属于原核生物界，厚壁菌门，柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，是一种主要感染牛呼吸道的病原体，其能够持续感染宿主，引发包括牛肺炎在内的多种慢性疾病，如乳腺炎、中耳炎、生殖障碍、关节炎、脑膜炎以及角膜结膜炎等，这些疾病常被称为牛支原体相关疾病(Mycoplasma bovis associateddisease，MbAD)。

目前检测牛支原体的方法大致包括以下。培养法是是检测病原体存在的直接证据，是检测M.bovis的金标准。一旦检出，即可确诊。可分为一般的固体培养法和快速培养法。然而由于M.bovis生长缓慢，从临床样本中初次分离一般需要盲传2～4代才能通过显微镜在固体培养基上看到菌落，需要数日才能得到检测结果，不仅检出率低，而且存在耗时过多、中间环节复杂、培养条件要求高等缺陷，给M.bovis的临床分离带来了一定的困难，不适合临床快速诊断。血清学检测技术具有特异性较高、灵敏度较好、快速、易于操作等优点，非常适合临床样本的快速检查和大规模的流行病学调查，但是支原体类大多具有共同抗原，容易造成假阳性的实验结果。免疫组化技术是一门将组织学与免疫学相结合的技术，是在组织细胞原位，通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，但对于病情不重或者选择病灶部位出现偏差较大时，免疫组化则难以检测到M.bovis的存在。在众多检测方法中，多聚酶链式反应是简便且行之有效的检测方法。PCR法检测快速、特异性和敏感性高，检测样本不需要是活体，不受患者免疫功能、病程、感染程度、有无使用药物治疗及未达到血清检测水平的影响，使早期诊断和抗生素的正确选择成为可能。对早期及未生成抗体者及抗体已消失的感染患者有积极的意义；有助于早期诊断，及时治疗，并且不存在交叉反应和放射性污染，易标准化。虽然PCR法检测快速，在某种意义上可替代培养法，但其高敏感性也使PCR法对实验环境和仪器要求比较高，存在着技术条件要求高、操作复杂、不易普及的问题，一般基层实验室难以开展，且价格也相对较高。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种快速、特异检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法。具体地，本发明包括以下内容：

本发明的第一方面，提供用于检测牛支原体的组合物，其包括能够与牛支原体的LppA基因杂交的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸。

本发明中，第一寡核苷酸的长度一般为35～45nt，优选为35～40nt。优选地，第一寡核苷酸的序列如SEQ ID No.1所示。本发明中，第二寡核苷酸的长度一般为35～50nt，优选为35～45nt，其在5’端带有Biotin标记。优选地，第二寡核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示，且在5’端带有Biotin标记。本发明中，第三寡核苷酸的长度一般为40～55nt，优选40～50nt。第三寡核苷酸的5’端带有检测标记，例如FAM荧光基团。第三寡核苷酸的3’端带有终止磷酸基团。第三寡核苷酸的序列中间含有THF切割位点。优选地，第三寡核苷酸的序列如SEQ ID No.3所示，且在5’端带有FAM，在3’端带有终止磷酸基团和在第31-32位碱基之间为idSp。