[发明专利]异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法

说明书

本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。

技术领域

本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种制备异硫氰酸荧光素衍生物的的方法。

背景技术

异硫氰酸荧光素(FITC)是在荧光素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团得到的。FITC中所含的硫氰酸基团可以和生物材料中氨基酸的氨基基团反应形成硫脲键，从而实现对生物材料的荧光标记。例如，FITC能和各种抗体分子中的氨基酸结合，形成FITC标记的抗体分子。在抗体与待检测生物材料中的抗原结合后，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。FITC是目前应用最广泛的荧光素，其在食品、医学、农学和畜牧等方面均有广泛的用途。

但是，FITC通常需要偶联在抗体等检测分子上才能使用，无法单独用于生物材料的检测。因此，期望能够有一种可以直接与生物材料中氨基酸连接，并能够实现荧光检测的新型标记物质。

发明内容

针对此问题，本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。

一方面，本发明提供了一种制备下式化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法，

其包括以下步骤：

(i)在-78℃下，加入化合物3和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂；1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物4；

(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂，并在0℃下加入亚硝酸钠，反应15分钟后加入叠氮化钠，并继续反应2小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品，过柱分离纯化，可得到化合物5；

(iii)在1,5-环辛二烯氯化铱二聚体催化和氮气保护下，使化合物5与化合物4在室温反应12小时，得到如化合物9所示的异硫氰酸荧光素衍生物。

在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物3、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为1:2:1。。

在一个实施方式中，在步骤(ii)中，化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为1:1.5:2。

在一个实施方式中，在步骤(iii)中，化合物5、化合物4和1,5-环辛二烯氯化铱二聚体的摩尔当量比为2:2:1。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。

在一个实施方式中，所述分离纯化步骤使用柱层析进行。

另一方面，本发明提供了一种制备下式化合物4的方法，

其包括以下步骤：

(i)将如下所示的化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴混合并反应，得到如下所示的化合物3；

(ii)在-78℃下，加入化合物3和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂，1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物4，

在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物3a、碳酸钾和炔丙基溴的摩尔当量比为3:1:2。