[发明专利]一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种生产L‑异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、苏氨酸脱水酶编码基因ilvA以及苏氨酸操纵子thrABC获得，ilvBN^M编码的乙酰羟酸合成酶在解除了L‑异亮氨酸对其的反馈抑制作用，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低；本发明所述的L‑异亮氨酸基因工程菌无营养缺陷、生长快、发酵周期短、产量高、转化率高，经过26‑36h发酵后，发酵液中的L‑异亮氨酸浓度达到42.5‑51.6g/L。

技术领域：

本发明涉及一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术：

L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-异亮氨酸是合成人体激素和酶的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-异亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。

L-异亮氨酸的合成方法有提取法、化学合成法和发酵法。工业化生产主要采用毛发提取法和发酵法合成L-异亮氨酸。由于提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，目前主要采用发酵法生产L-异亮氨酸。目前，L-异亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。

发明内容：

为了克服目前野生型乙酰羟酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制以及现有L-异亮氨酸生产菌株生长慢、营养缺陷、发酵不稳定等不足，本发明提供一种解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体及其编码基因，并利用该基因构建生产L-异亮氨酸的基因工程菌。

本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述乙酰羟酸合成酶突变体的编码基因为ilvBN^M，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述乙酰羟酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上筛选出菌株ILE396；以ILE396为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株ILE693。

提取ILE693基因组，通过设计引物进行PCR扩增乙酰羟酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的乙酰羟酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型乙酰羟酸合成酶发生如下氨基酸突变：K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、乙酰羟酸合成酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示乙酰羟酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如K30Q，表示位置30的氨基酸由野生型乙酰羟酸合成酶的Lys替换成Gln，K30表示第30位的氨基酸为Lys，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列编号。