[发明专利]检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用。黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL在323的位置存在一处SNP位点，本发明基于该SNP位点开发了KASP引物、包含该KASP引物的试剂盒。本发明的KASP引物及含有KASP引物的试剂盒可用于鉴定黄瓜是否含有黄瓜细菌性角斑病抗性基因，区分抗黄瓜细菌性角斑病黄瓜和感黄瓜细菌性角斑病黄瓜。本申请所提供的分子标记可对黄瓜植株在苗期大通量地进行快速、准确的抗病性鉴定，从而提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜细菌性角斑病基因的KASP引物及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是国际上第三大蔬菜作物，在中国的种植面积居世界首位。黄瓜细菌性角斑病(Angular leaf spot,ALS)是黄瓜生产中最具毁灭性的世界性病害之一。在我国随着温室种植面积的日益扩大，黄瓜细菌性角斑病成为温室黄瓜生产的最严重的病害之一，严重影响果实的品质和产量，导致严重的经济损失，因此选育抗病品种就显得十分重要。

细菌性角斑病是由丁香假单胞杆菌黄瓜细菌角斑病致病变种(Pseudom onassyringae pv.Lachrymans，psl)引起的叶部病害，但也会对黄瓜植株叶柄、茎蔓和瓜条造成危害。细菌性角斑病病原菌可附着于黄瓜种子内外传播给下一代，也可寄生在土壤中成为翌年的初侵染源。细菌性角斑病典型的症状是叶片上有水渍状且受叶脉限制的黄色病斑，叶片背面病斑处常有白色菌脓，病斑对向太阳会有晕圈，后期叶片会坏死；果实发病初为水渍状，逐渐变成褐色凹陷病斑，龟裂，分泌出白色黏液，最终使得果实变得畸形。黄瓜发生细菌性角斑病危害后通常减产30％-50％，严重时损失高达50％-60％，有的甚至绝收。因此培育和推广抗细菌性角斑病的黄瓜品种是最有效的方法。

近年来基于DNA序列多态性的分子标记收到国内外育种行业的高度重视，利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行选择不受环境影响，选择结果可靠，而且在聚合有利性状时可以在回交渗透过程中通过遗传背景选择，减少连锁累赘、加速育种进程。因此，通过现代分子生物学手段开发控制黄瓜重要性状的分子标记，对黄瓜育种具有重要意义。

目前黄瓜遗传育种中常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、CAPS、SNP等。随着黄瓜基因的克隆基于黄瓜功能基因开发的功能标记也逐渐得到应用。尽管这些功能标记在黄瓜功能基因检测方面已经得到部分应用，但是操作过程繁琐复杂，需要酶切、电泳，耗费时间长，并且检测效率低。在育种过程中，广大育种人员筛选大量后代材料，需要较高成本，花费较长的时间，难以满足生产需要。因此，建立一种快速、高效、便捷的检测方法非常必要。

KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。

KASP的特异性引物通常采用24bp-26bp，会有更高的特异性，对比常规酶切电泳准确率高；只需常规PCR扩增，所需时间短；无需昂贵的双色标记探针，灵活性超强；最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增；快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。

其主要操作步骤如下：

1、含有SNP位点的等位基因-1和-2作为模板；

2、针对等位基因SNP位点设计特异性引物：两个正向引物和一个通用反向引物；

3、两条正向引物5’端分别连有特异性的检测引物序列，可与荧光标记结合；

4、提取待测样品的基因组DNA为模板；

5、PCR扩增，对扩增产物进行荧光信号扫描，数据分析。